本文關(guān)鍵詞：甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌鉀、鈉離子通道表達的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 甲基苯丙胺(Methamphetamine, MA)是一種屬于苯丙胺類的精神興奮劑,俗稱為冰毒,是聯(lián)合國精神藥品公約管制的精神活性毒品,具有價格相對低廉、見效快和藥效維持時間長的特點,使之成為了廣泛被濫用的毒品。甲基苯丙胺在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是一種高度活躍的興奮劑,從而導致成癮行為。但其在作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的同時,也對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生毒性影響,包括血管收縮、動脈缺血、心率增加、血壓增加、心律失常和心律失常性猝死等已經(jīng)被廣泛的報道,成為了甲基苯丙胺心臟毒性的指標。 甲基苯丙胺除了對心率和血壓有影響,也擾亂了心臟的電活動協(xié)調(diào),造成心電圖中QT間隔的延長,因此,甲基苯丙胺誘導的心臟性猝死可能與心臟的電活動異常有關(guān)。甲基苯丙胺濫用者的心電圖中QT間隔的延長,提示了甲基苯丙胺濫用者易患有心室性心律失常,尤其是扭轉(zhuǎn)型室性心動過速。這些電生理的變化可能歸因于甲基苯丙胺對心臟離子通道的影響。 甲基苯丙胺可能直接作用于離子通道從而導致心律失常,也可能是甲基苯丙胺引起心肌細胞損傷后,細胞內(nèi)離子及電生理活動發(fā)生了改變,導致了心電節(jié)律異常,從而間接導致了心臟的毒性損傷。但是,甲基苯丙胺對心臟離子通道的表達的影響并沒有被證實。 本實驗從體外及體內(nèi)兩個研究體系入手,主要研究甲基苯丙胺是否可以影響鉀離子通道和鈉離子通道相關(guān)亞基的表達,探討甲基苯丙胺對心臟的毒性作用。分析甲基苯丙胺對大鼠心室肌離子通道的表達水平的影響。同時,對甲基苯丙胺停藥后大鼠心室肌離子通道的表達的可逆效應(yīng)作出評估,探討甲基苯丙胺引起的電生理重構(gòu)后果與離子通道表達重構(gòu)之間的聯(lián)系。 目的 通過在體外環(huán)境構(gòu)建甲基苯丙胺染毒原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞毒性模型,調(diào)查甲基苯丙胺對大鼠心室肌細胞離子通道的影響；通過在體內(nèi)環(huán)境構(gòu)建甲基苯丙胺急性中毒大鼠模型,驗證體外環(huán)境甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞的毒性作用,研究及分析甲基苯丙胺對大鼠心室肌離子通道的表達水平的影響；建立急性中毒后不同時間的停藥模型,探討甲基苯丙胺對大鼠心室肌離子通道影響的可恢復性和停止染毒后不同時間的恢復程度。 以上研究為甲基苯丙胺誘導心律失常發(fā)生,提供分子和電生理機制的基礎(chǔ)。 方法 本實驗分成兩個部分,分別從體外與體內(nèi)兩個方向?qū)谆奖芬鸬男氖壹《拘赃M行研究。 一、甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞的影響 1、甲基苯丙胺染毒原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞模型的建立 (1)出生1天內(nèi)的SD乳鼠,雌雄不拘,心室肌細胞分離及原代培養(yǎng),將培養(yǎng)72h已呈規(guī)律搏動的心室肌細胞隨機分為四組,棄去培養(yǎng)基,Hank's液輕柔洗滌一次,按照0.5/1.0/1.5mM濃度分別給予含有相應(yīng)濃度甲基苯丙胺的D-MEM液,并設(shè)立對照組,一并放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。 (2)甲基苯丙胺染毒后對心室肌細胞進行形態(tài)學觀察。 2、甲基苯丙胺對原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌鉀、鈉離子通道蛋白影響 (1)實時熒光定量PCR技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞SCNNIA, SCNNIB, KCNA4, KCNA7, KCNC4, KCND2, KCNJ2, KCNJ12, KCNJ4, KCNJ14基因表達水平。 (2)Western Blot技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞SCNN1A,SCNN1B,KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4, KCNJ14蛋白表達水平。二、甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌的影響 1、急性組和停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠模型建立 (1)急性組(M1組)：200-220g雄性SD大鼠10只,單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)于晝夜循環(huán)(光照14小時/天)空調(diào)恒溫25℃的動物房,自由進食飲水,適應(yīng)一周后,腹腔注射5mg/Kg甲基苯丙胺生理鹽水溶液,2次/天(8AM及8PM各1次),連續(xù)給藥一周(共14次)。建模成功后24小時心臟取材。 (2)停藥組：200-220g雄性SD大鼠40只,隨機分成W1、W2、W4和W8四組,每組10只,單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)于晝夜循環(huán)(光照14小時/天)空調(diào)恒溫25℃的動物房,自由進食飲水,適應(yīng)一周后,腹腔注射5mg/Kg甲基苯丙胺生理鹽水溶液,2次/天(8AM及8PM各1次),連續(xù)給藥一周(共14次)。急性中毒建模成功后,停藥喂養(yǎng)一周(Wl組)、兩周(W2組)、四周(W4組)、八周(W8組),建模成功后24小時心臟取材。 (3)對照組(S1組)：200-220g雄性SD大鼠10只,將甲基苯丙胺生理鹽水溶液換為等量生理鹽水溶液,余處理同急性組,建模成功后24小時心臟取材。 2、甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌鉀離子通道表達的影響 (1)實時熒光定量PCR技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用急性組和停藥組大鼠KCNA4, KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14基因表達水平. (2)Western Blot技術(shù)：檢測甲基苯丙胺作用急性組和停藥組大鼠KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14蛋白表達水平. 結(jié)果 一、甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞的影響 1、甲基苯丙胺染毒原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞模型的建立 甲基苯丙胺給藥24小時后,0.5mM、1.0mM組及1.5mM組細胞搏動頻率增快,細胞的形態(tài)未見明顯變化。給藥48小時后,0.5mM組細胞細胞搏動逐漸平復回落,少數(shù)的細胞變圓變扁梭；1.OmM組細胞搏動逐漸平復并明顯變慢,并呈不規(guī)則搏動,細胞變圓變扁梭；1.5mM組細胞搏動頻率不規(guī)則并明顯變慢。隨著染毒時間的遞增,細胞損傷加重,最終細胞停止搏動,白皿上脫落、死亡。1.5mM組細胞損傷程度較1.0mM組為重并且快。在此期間,對照組心室肌細胞生長良好,細胞搏動規(guī)則有力。 2、甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞鉀、鈉離子通道表達的影響 0.5mM濃度的甲基苯丙胺染毒處理原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞鈉離子通道各亞基的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平存在相應(yīng)的變化。甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞鈉離子通道SCNN1A, SCNN1B亞基的基因表達水平并無影響,與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05).SCNNlA:Con為1.004±0.015,MA為1.039±0.051；SCNN1B:Con為1.004±0.025,MA為0.985±0.060。甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞鈉離子通道SCNN1A, SCNN1B亞基的蛋白表達水平并無影響,與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05).(SCNN1A:Con為1.004±0.015,MA為1.069±0.081；SCNN1B:Con為1.004±0.025,MA為0.981±0.090)。0.5mM濃度的甲基苯丙胺染毒處理后原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞內(nèi)鉀離子通道各亞基KCNA4,KCNA7,KCNC4,KCND2,KCNJ2,KCNJ12,KCNJ4,KCNJ14的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平存在相應(yīng)的下調(diào)變化,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。轉(zhuǎn)錄水平：KCNA4:Con為1.000±0.013,MA為0.515±0.052；KCNA7:Con為1.000±0.011,MA為0.539±0.041；KCNC4:Con為1.000±0.020,MA為0.303±0.080；KCND2:Con為1.000±0.015,MA為0.366±0.050；KCNJ2:Con為1.000±0.022,MA為0.411±0.061；KCNJ12:Con為1.003±0.015,MA為0.343±0.063；KCNJ4:Con為1.002±0.019,MA為0.418±0.052；KCNJ14:Con為1.001±0.015,MA為0.537±0.041).翻譯水平：KCNA4:Con為1.004±0.019, MA為0.225±0.062；KCNA7:Con為1.001±0.015,MA為0.527±0.051；KCNC4:Con為1.001±0.036,MA為0.184±0.060；KCND2:Con為1.000±0.018,MA為0.555±0.050;KCNJ2:Con為1.003±0.016,MA為0.410±0.051;KCNJ12: Con為1.003±0.024,MA為0.298±0.050；KCNJ4:Con為1.006±0.015,MA為0.591±0.052；KCNJ14:Con為1.006±0.022,MA為0.398±0.041. 二、甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌的影響 1、急性組和停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立 實驗組動物腹腔注射甲基苯丙胺后約10分鐘開始出現(xiàn)活動和行為異常,主要表現(xiàn)有立毛、翹尾,磨牙、運動增多、不自主的搖頭和點頭、自發(fā)轉(zhuǎn)圈運動,遇響動或輕微刺激易激惹、個別動物啃咬前肢及足趾,實驗組動物出現(xiàn)了刻板運動及自殘行為。活動和行為異常持續(xù)至注射后4小時左右,藥效消退后動物表現(xiàn)為活動減少、蜷縮、進食量減少。 2、甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌鉀離子通道表達的影響 甲基苯丙胺急性中毒期的大鼠心室肌內(nèi)鉀通道蛋白的mRNA水平及蛋白水平表達的下降。KCNA4的mRNA表達下降55%,蛋白表達下降86%;KCNA7的mRNA表達下降69%,蛋白表達下降60%;KCNC4的mRNA表達下降77%,蛋白表達下降80%;KCND2的mRNA表達下降60%,蛋白表達下降53%；KCNJ2的mRNA表達下降79%,蛋白表達下降70%；KCNJ12的mRNA表達下降80%,蛋白表達下降81%；KCNJ4的mRNA表達下降67%,蛋白表達下降60%;KCNJ14的mRNA表達下降65%,蛋白表達下降86%。 甲基苯丙胺停藥期中,KCNA4在停藥后一周及兩周,mRNA表達未發(fā)生明顯變化,蛋白表達在停藥后一周恢復33%,在停藥后兩周恢復37%,在停藥后四周后,mRNA表達恢復30%,蛋白表達恢復57%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復89%,蛋白表達恢復94%;KCNA7在停藥后一周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在停藥后兩周,mRNA表達未發(fā)生明顯變化,蛋白表達恢復45%,在停藥后四周后,mRNA表達恢復41%,蛋白表達恢復50%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復81%,蛋白表達恢復52%；KCNC4在停藥后一周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在停藥后兩周后,mRNA表達恢復24%,蛋白表達恢復34%,在停藥后四周后,mRNA表達恢復66%,蛋白表達恢復62%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復75%,蛋白表達恢復89％；KCND2在停藥后一周,mRNA表達下降43%,蛋白表達下降47%,在停藥后兩周,mRNA表達下降12%,蛋白表達與給藥組沒有差異,在停藥后四周后,mRNA表達恢復65%,蛋白表達恢復67%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復85%,蛋白表達恢復74%。 KCNJ2在停藥后一周,mRNA表達恢復20%,蛋白表達恢復25%,在停藥后兩周后,mRNA表達恢復34%,蛋白表達恢復22%,在停藥后四周后,mRNA表達恢復38%,蛋白表達恢復23%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復49%,蛋白表達恢復50％；KCNJ12在停藥后一周及兩周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在停藥后四周后,mRNA表達恢復35%,蛋白表達恢復39%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復66%,蛋白表達恢復68%；KCNJ4在停藥后一周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在停藥后兩周后,mRNA表達恢復26%,蛋白表達恢復21%,在停藥后四周后,mRNA表達恢復36%,蛋白表達恢復12%,在停藥后八周后,mRNA表達恢復42%,蛋白表達恢復16%;KCNJ14在停藥后一周,mRNA表達及蛋白表達均未發(fā)生明顯變化,在停藥后兩周后,mRNA表達恢復38%,蛋白表達未發(fā)生明顯變化,在停藥后四周后,mRNA表達恢復60%,蛋白表達未發(fā)生明顯變化,在停藥后八周后,mRNA表達恢復70%,蛋白表達恢復37%。 結(jié)論 本實驗選擇了使用分化完成之前分離的原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞,不同濃度的甲基苯丙胺給藥后,細胞搏動頻率均為開始時增快隨后減慢,隨著染毒時間的遞增,細胞損傷加重,最終細胞停止搏動、死亡。 在體外研究體系中,甲基苯丙胺引起了鉀離子通道各亞基mRNA水平和蛋白水平的下降。甲基苯丙胺對心室肌細胞的瞬時外向鉀電流(Ito)和內(nèi)向整流鉀電流(IKl)通道有抑制性影響,對相應(yīng)的離子通道表達也有抑制性影響。由于運作的離子通道的數(shù)量的減少可以導致Itp,IKl的減低,所以離子通道表達水平是一個合理的指標去評估甲基苯丙胺對致心律失常性重構(gòu)涉及到的離子通道的影響。另外,轉(zhuǎn)錄或翻譯的Ito, Ik1基因減少也可以導致離子通道數(shù)量的減少。 急性組和停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立過程中能觀察到注射給藥后10分鐘左右,大鼠出現(xiàn)了明顯的毒性反應(yīng),活動和行為異常、刻板運動及自殘行為。興奮、易激惹、不自主的轉(zhuǎn)圈、搖頭和點頭,并伴有呼吸深快、立毛、翹尾、磨牙、等改變。數(shù)小時后藥效消退,大鼠出現(xiàn)了精神萎靡、明顯的活動減少、進食量減少。這些表現(xiàn)均符合甲基苯丙胺中毒的藥理作用特點。 在體內(nèi)研究體系中,甲基苯丙胺引起了鉀離子通道各亞基mRNA水平和蛋白水平的下降。甲基苯丙胺對Ito, Ik1有抑制性影響,對相應(yīng)的鉀離子通道各亞基的表達也有抑制性影響。 甲基苯丙胺停藥后,鉀離子通道各亞基表達存在可逆變化。當甲基苯丙胺停藥2周后,可以觀察到某些離子通道亞基的表達有略微可逆的調(diào)節(jié)。大多數(shù)離子通道亞基的表達則沒有改變。大多數(shù)離子通道亞基的表達在甲基苯丙胺停藥后兩周內(nèi)仍然保持相對不可逆轉(zhuǎn)的狀態(tài)。在一定的程度上,離子通道的功能會受到影響并可能誘導電流重構(gòu)。因此,這個時期正正可能是甲基苯丙胺誘導心律失常出現(xiàn)的風險時期。 大多數(shù)離子通道亞基的表達在甲基苯丙胺停藥后四周開始恢復。甲基苯丙胺停藥后八周,所有的離子通道亞基均可觀察到表達的恢復。離子通道亞基表達的恢復可能有助于改善離子通道的功能,從而緩解對電流重構(gòu)的影響。 盡管如此,甲基苯丙胺停藥后八周各離子通道亞基恢復的表達與對照組的表達相比還是有一些差距。本實驗的數(shù)據(jù)表明,鉀離子通道各亞基的表達仍然無法恢復到對照組的表達水平,進一步表明了即使甲基苯丙胺停藥后兩個月,鉀離子通道各亞基的表達重構(gòu)仍然繼續(xù)存在,因此,甲基苯丙胺誘導心律失常的風險可能會存在一段時間。 我們發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺停藥后八周,Kir2.0家族的可恢復性比其他亞基的恢復性較差。Kir2.0家族較差的可恢復性提示IkI電流和離子信號的改變增加了心律失常發(fā)生的風險。Ikl的生理功能是調(diào)整靜態(tài)電位和動作電位的復極化。IKl的抑制可以提高膜電位和延長動作電位持續(xù)時間。研究結(jié)果表明,Kir2.0家族表達的重構(gòu)可能是甲基苯丙胺誘導心臟損傷在康復期晚期心律失常發(fā)生的一個可能的誘導因素。
【關(guān)鍵詞】：甲基苯丙胺 鉀離子通道 鈉離子通道 心臟毒性 心律失常
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：D919.1
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-30
• 參考文獻25-30
• 第一章 甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞的影響30-52
• 第一節(jié) 甲基苯丙胺染毒原代培養(yǎng)新生大鼠心室肌細胞模型的建立30-35
• 1.1 材料與方法30-33
• 1.2 結(jié)果33-34
• 1.3 討論34-35
• 第二節(jié) 甲基苯丙胺對新生大鼠心室肌細胞鉀、鈉離子通道表達的影響35-50
• 2.1 材料與方法35-46
• 2.2 結(jié)果46-49
• 2.3 討論49-50
• 參考文獻50-52
• 第二章 甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌的影響52-88
• 第一節(jié) 急性組和停藥組甲基苯丙胺中毒大鼠模型的建立52-56
• 1.1 材料與方法52-54
• 1.2 結(jié)果54
• 1.3 討論54-56
• 第二節(jié) 甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌鉀離子通道表達的影響56-86
• 2.1 方法與材料56-66
• 2.2 結(jié)果66-84
• 2.3 討論84-86
• 參考文獻86-88
• 全文小結(jié)88-89
• 中英文縮略對照表89-90
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表及撰寫論文情況90-91
• 致謝91-92

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張西;;苯丙胺類興奮劑三次濫用高峰的歷史嬗變[J];中國人民公安大學學報(自然科學版);2011年01期

2 ;MYOCARDIAL LESIONS AFTER LONG-TERM ADMINISTRATION OF METHAMPHETAMINE IN RATS[J];Chinese Medical Sciences Journal;2008年04期

  本文關(guān)鍵詞：甲基苯丙胺對急性中毒期和停藥期的大鼠心室肌鉀、鈉離子通道表達的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：397432