目的:法醫(yī)物證檢驗涉及到最常見的生物檢材之一是精液和陰道液混合斑,從混合斑中分離出男性的特有成分精子是目前性犯罪案件的難點。針對混合斑分離精液和陰道液組分進行檢測以及精液特有成分檢測的方法有多種,但是有時會因為女性成分如陰道上皮細胞數(shù)量遠多于精子數(shù)量,造成了獲得精子難度提升,或者即使獲得但是精子不完整或者并非單一成分,這導致后續(xù)提取精子DNA難度加大,更無法進行個人識別鑒定。卵膜糖蛋白,也叫透明帶(zona pellucida,ZP)是一種包裹在哺乳動物卵母細胞周圍的糖蛋白半透明基質,在受精過程中起著至關重要的作用。在人類中,ZP由四種糖蛋白組成,分別為ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。其中,hZP3是精卵識別結合的初級受體,在受精過程中,與精子結合,誘發(fā)精子一系列反應,包括精子膜活化、酪氨酸磷酸化和頂體反應等,在精卵結合、頂體反應、防止多精入卵以及保護卵細胞和著床前的胚胎等方面發(fā)揮著重要的作用。hZP3的功能肽段,氨基酸序列214-305aa,(命名為Truncated ZP3(TrZP3))是誘導精子頂體反應的關鍵肽段。研究已經(jīng)證明重組hZP3和TrZP3在結構和功能上與天然ZP3接...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分:重組人卵膜糖蛋白3在真核細胞中的表達及與精子體外結合的探討
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料與試劑
            2.1.1 實驗樣品
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 重組質粒DNA提取和酶切驗證
            2.2.2 真核細胞HEK293 培養(yǎng)
            2.2.3 真核細胞HEK293 轉染
            2.2.4 細胞蛋白提取和濃度測定
            2.2.5 hZP3 純化
            2.2.6 hZP3 蛋白免疫印跡法檢測
            2.2.7 純化hZP3 ELISA法檢測
            2.2.8 精子樣品制備
            2.2.9 純化hZP3 與精子體外結合檢測
    3 結果
        3.1 重組hZP3 蛋白在真核細胞中成功表達
            3.1.1 重新培養(yǎng)的細菌經(jīng)裂解純化后成功獲得重組質粒
            3.1.2 重組質粒在真核細胞中得到高效表達
            3.1.3 利用標簽蛋白純化獲得了hZP3-His融合蛋白
        3.2 重組hZP3 蛋白與精子體外結合
            3.2.1 純化的hZP3-His融合蛋白與特異性抗體結合具有劑量效應
            3.2.2 純化的hZP3-His融合蛋白與精子體外未觀察到明顯結合
    4 討論
        4.1 融合蛋白hZP3-His在真核細胞HEK293 中的表達
        4.2 融合蛋白hZP3-His與精子體外結合的探究
    5 結論
第二部分:穩(wěn)定表達人ZP3(214-305aa)CHO系的建立及ZP3(214-305aa)與精子體外結合的研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料與試劑
            2.1.1 實驗樣品
            2.1.2 主要試劑與耗材
            2.1.3 主要儀器
        2.2 實驗方法
            2.2.1 重組質粒DNA的提取
            2.2.2 真核細胞CHO-K1 培養(yǎng)
            2.2.3 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細胞系構建
            2.2.4 TrZP3 蛋白免疫印跡法檢測
            2.2.5 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細胞熒光顯微鏡觀察
            2.2.6 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細胞免疫熒光法檢測
            2.2.7 TrZP3 純化
            2.2.8 純化TrZP3 ELISA法檢測
            2.2.9 純化TrZP3 與梯度精子體外結合檢測
            2.2.10 純化TrZP3 與精子體外梯度時間結合檢測
    3 結果
        3.1 穩(wěn)定表達hZP3(214-305aa)CHO細胞系構建成功
            3.1.1 重組質粒在真核細胞CHO中得到穩(wěn)定表達
            3.1.2 穩(wěn)定CHO-TrZP3 細胞生長狀態(tài)良好
            3.1.3 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His在穩(wěn)定細胞的胞質中均勻表達
            3.1.4 利用His標簽蛋白純化獲得了融合蛋白EGFP-TrZP3-6His
        3.2 hZP3(214-305aa)與精子體外結合
            3.2.1 純化獲得的融合蛋白與抗GFP抗體結合表現(xiàn)出劑量效應
            3.2.2 純化的融合蛋白與梯度精子在體外未檢測到結合
            3.2.3 純化的融合蛋白與精子體外孵育不同時間未檢測到結合
    4 討論
        4.1 穩(wěn)定細胞系構建和融合蛋白EGFP-ZP3-6His表達
        4.2 融合蛋白EGFP-TrZP3-6His與精子體外結合的研究
    5 結論
第三部分:三個常染色體InDel遺傳標記的多態(tài)性調查及與帕金森病相關性分析
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 研究對象
        2.2 實驗材料和試劑
            2.2.1 主要試劑與耗材
            2.2.2 主要儀器
        2.3 實驗方法
            2.3.1 基因組DNA分離和基因分型
            2.3.2 GIGYF2 的毛細管電泳
            2.3.3 DNA測序
            2.3.4 統(tǒng)計學分析
    3 結果
        3.1 ACE和 DJ-1 InDel多態(tài)性的基因分型
        3.2 GIGYF2 基因的InDel與 PD相關
        3.3 PD相關的InDel基于性別的遺傳分布差異
        3.4 三個 InDel 位點的法醫(yī)學參數(shù)
    4 討論
        4.1 三個InDel遺傳標記的法醫(yī)學意義
        4.2 三種不同的InDel與 PD關聯(lián)性
            4.2.1 ACE的 InDel多態(tài)性與PD關聯(lián)性
            4.2.2 DJ-1的InDel多態(tài)性與PD關聯(lián)性
            4.2.3 GIGYF2的InDel多態(tài)性與PD關聯(lián)性
            4.2.4 三種InDel多態(tài)性性別分層與PD關聯(lián)性
    5 結論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3804276