本文關(guān)鍵詞：脂肪來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：涎腺的放射損傷常使其功能低下甚至喪失,引發(fā)一系列功能障礙。對(duì)于涎腺放射損傷,傳統(tǒng)的治療手段治療效果有限,不能從根本上解決問(wèn)題。近年來(lái),干細(xì)胞的研究逐漸深入,許多疾病的治療在未來(lái)成為可能,其中骨髓干細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在涎腺放射損傷中起到一定的改善功能的效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn),ADSCs復(fù)合富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)可以在一定程度上改善放射損傷后涎腺的功能,并且較單純的ADSCs治療效果更好。但相關(guān)的作用機(jī)制尚不清楚,我們根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道,推測(cè)ADSCs之所以能修復(fù)涎腺放射損傷是因?yàn)槠湎蛳严傧倥輼蛹?xì)胞(salivary gland acinar-like cells,SGALCs)轉(zhuǎn)分化,并且PRF起到促進(jìn)轉(zhuǎn)分化的作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究以體外涎腺細(xì)胞(salivary gland cells,SGCs)和ADSCs共培養(yǎng),并施加PRF干預(yù),驗(yàn)證我們的猜想。目的探討ADSCs向SGALCs轉(zhuǎn)分化的可能性,并探究PRF在轉(zhuǎn)分化中的作用,為ADSCs復(fù)合PRF治療涎腺放射損傷提供理論依據(jù),同時(shí)為涎腺組織工程再生提供一種更合適的種子細(xì)胞。方法1.無(wú)菌切取C3H小鼠下頜下腺,分離培養(yǎng)下頜下腺細(xì)胞,觀察活細(xì)胞形態(tài),HE染色細(xì)胞形態(tài)及透射電鏡下腺泡細(xì)胞特有的酶原顆粒,并通過(guò)細(xì)胞角蛋白8(cytokeratin8,CK8)及波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色,α-淀粉酶免疫熒光染色及Western Blot從蛋白水平,通過(guò)CK8、vimentin、α-淀粉酶及水通道蛋白5(aquaporin-5,AQP-5)的m RNA RT-PCR檢測(cè)從基因水平鑒定細(xì)胞來(lái)源。2.無(wú)菌切取C3H小鼠腹股溝脂肪帶,分離培養(yǎng)ADSCs,觀察活細(xì)胞形態(tài),HE染色細(xì)胞形態(tài),MTT測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式檢測(cè)干細(xì)胞表面分子,成脂及成骨鑒定細(xì)胞干性。3.抽取兔耳中動(dòng)脈血,離心制備PRF,將獲得的PRF凝膠凍干并研磨成顆粒,按25mg PRF顆粒/1ml無(wú)血清培養(yǎng)基的比例制備PRF浸提液,用ELISA檢測(cè)其體外釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PFGF-BB)的特點(diǎn),并研究其對(duì)ADSCs增殖,遷移和骨向分化的影響。4.利用孔徑為0.4μm的Transwell小室放置于孔板中建立共培養(yǎng)系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)組將獲得的下頜下腺細(xì)胞培養(yǎng)在上層小室內(nèi),ADSCs培養(yǎng)在下層孔板中。對(duì)照組上層小室內(nèi)不含有下頜下腺細(xì)胞。在培養(yǎng)7天,14天和21天后,分別取對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,觀察ADSCs的形態(tài),通過(guò)α-淀粉酶,CK8及vimentin免疫熒光染色鑒定轉(zhuǎn)分化情況;通過(guò)α-淀粉酶免疫熒光染色計(jì)數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞,計(jì)算轉(zhuǎn)分化率;最后通過(guò)α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)分化情況。5.在ADSCs成骨誘導(dǎo)體系中加入不同濃度的PRF浸提液(0.5%,1%,3%,5%,7%,10%),誘導(dǎo)7天后檢測(cè)成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型膠原(collagenⅠ,COLⅠ),runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor2,RUNX2)及骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)的表達(dá),并于21天行茜素紅染色。此外,以共培養(yǎng)系統(tǒng)為基礎(chǔ),添加不同濃度的PRF浸提液(0.5%,1%和5%),共培養(yǎng)7天后,正常共培養(yǎng)組與不同濃度PRF浸提液組分別進(jìn)行α-淀粉酶免疫熒光染色,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)算脂肪來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化率,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)對(duì)不同濃度PRF浸提液組進(jìn)行α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析。結(jié)果1.成功培養(yǎng)具有良好功能的涎腺細(xì)胞:體外分離培養(yǎng)的小鼠下頜下腺細(xì)胞呈多邊形或卵圓形,密集排列時(shí)呈鋪路石樣;HE染色胞漿呈紅色,胞核呈藍(lán)色,基本位于細(xì)胞中央;透射電鏡觀察到胞漿內(nèi)存在黑色致密的顆粒,即為酶原顆粒;免疫熒光染色α-淀粉酶及CK8呈陽(yáng)性,波形蛋白呈陰性;α-淀粉酶Western Blot顯示約53k Da處呈現(xiàn)特異性條帶;RT-PCR結(jié)果顯示下頜下腺細(xì)胞表達(dá)CK8、α-淀粉酶及AQP-5,不表達(dá)波形蛋白。2.成功培養(yǎng)功能良好的脂肪來(lái)源干細(xì)胞:體外分離培養(yǎng)的小鼠ADSCs呈長(zhǎng)梭形,有胞突,密集排列時(shí)呈魚(yú)群樣。HE染色胞漿呈紅色,胞核成藍(lán)色。其生長(zhǎng)曲線大致呈“S”型,與其他干細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)相似。ADSCs陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,并具備成脂成骨分化能力。3.富血小板纖維蛋白能持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子且一定劑量?jī)?nèi)能促進(jìn)脂肪來(lái)源干細(xì)胞的增殖和遷移:由兔耳中動(dòng)脈血離心制備的PRF凝膠凍干后,可研磨成顆粒狀,其能持續(xù)釋放VEGF和PDGF-BB。不同濃度的PRF浸提液對(duì)ADSCs的生物學(xué)行為影響不同,其中以1%PRF浸提液組對(duì)ADSCs增殖和成骨分化具有較明顯的促進(jìn)作用,以50%PRF浸提液組對(duì)ADSCs的遷移具有較明顯促進(jìn)作用。4.脂肪來(lái)源干細(xì)胞能轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞:下頜下腺細(xì)胞誘導(dǎo)ADSCs發(fā)生轉(zhuǎn)分化,干細(xì)胞α-淀粉酶及CK8免疫熒光染色呈現(xiàn)陽(yáng)性,第7天,14天,21天的轉(zhuǎn)分化率分別為:22.87±1.66%;40.56±1.74%;49.84±1.93%。轉(zhuǎn)分化后干細(xì)胞α-淀粉酶Western Blot顯示,第7天,14天,21天樣本在53k Da處出現(xiàn)條帶,其灰度值依次增高。α-淀粉酶,AQP-5及CK8 m RNA RT-PCR分析結(jié)果顯示三者m RNA含量在第7天,14天,21天依次增加,Vimentin m RNA表達(dá)量依次降低。對(duì)照組干細(xì)胞未發(fā)生轉(zhuǎn)分化。5.一定劑量的PRF能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化:與正常成骨誘導(dǎo)相比,0.5%,1%,3%和5%PRF浸提液組的ALP,COLⅠ,RUNX2及OCN表達(dá)量較高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這四組中茜素紅染色可見(jiàn)更多的礦化結(jié)節(jié)。共培養(yǎng)系統(tǒng)中,0.5%PRF浸提液組,1%PRF浸提液組和5%PRF浸提液組的干細(xì)胞7天轉(zhuǎn)分化率分別為30.39±1.51%,36.20±1.33%,28.78±0.83%。與正常共培養(yǎng)組相比,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且不同濃度PRF浸提液組之間比較,以1%PRF浸提液組轉(zhuǎn)分化率最高,與其他組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。α-淀粉酶Western Blot及α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析顯示,PRF浸提液組與正常組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),不同濃度PRF浸提液組間比較,以1%PRF浸提液組表達(dá)量最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.成功分離培養(yǎng)小鼠下頜下腺細(xì)胞,呈多邊形,具有較強(qiáng)增殖能力,胞內(nèi)含有特異性酶原顆粒,能表達(dá)特異性的α-淀粉酶,為具備良好功能的涎腺細(xì)胞。2.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞,長(zhǎng)梭形,自我更新能力較強(qiáng),干細(xì)胞表面標(biāo)志性CD分子呈陽(yáng)性,具有成脂成骨的分化潛能,為性能優(yōu)良的干細(xì)胞。3.富血小板纖維蛋白富含多種生長(zhǎng)因子,在培養(yǎng)液中能穩(wěn)定且規(guī)律性的釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB。富血小板纖維蛋白浸提液能促進(jìn)脂肪來(lái)源干細(xì)胞的增殖和遷移,呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。4.脂肪來(lái)源干細(xì)胞可以在體外轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞,且在一定時(shí)間內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),脂肪來(lái)源干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化率逐漸增加。5.在一定劑量范圍內(nèi)富血小板纖維蛋白能促進(jìn)脂肪來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞。6.脂肪來(lái)源干細(xì)胞和富血小板纖維蛋白可以在一定程度上解決涎腺組織工程再生的種子細(xì)胞問(wèn)題。
【關(guān)鍵詞】：涎腺細(xì)胞 脂肪來(lái)源干細(xì)胞 富血小板纖維蛋白 共培養(yǎng) 轉(zhuǎn)分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.55;R781.7
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-17
• 文獻(xiàn)回顧17-27
• 實(shí)驗(yàn)一 C3H小鼠涎腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定27-39
• 1 材料27-28
• 2. 方法28-34
• 3. 結(jié)果34-37
• 4. 討論37-39
• 實(shí)驗(yàn)二 C3H小鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定39-47
• 1. 材料39-40
• 2. 方法40-42
• 3. 結(jié)果42-45
• 4. 討論45-47
• 實(shí)驗(yàn)三 脂肪來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究47-56
• 1. 材料47-48
• 2. 方法48-49
• 3. 結(jié)果49-53
• 4. 討論53-56
• 實(shí)驗(yàn)四 富血小板纖維蛋白的生物學(xué)特性及對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和遷移的影響56-67
• 1. 材料56-57
• 2. 方法57-61
• 3. 結(jié)果61-64
• 4. 討論64-67
• 實(shí)驗(yàn)五 富血小板纖維蛋白對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響67-77
• 1. 材料67
• 2. 方法67-69
• 3. 結(jié)果69-74
• 4. 討論74-77
• 小結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果84-85
• 致謝85

【相似文獻(xiàn)】

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1 趙建輝;易成剛;郭樹(shù)忠;;脂肪來(lái)源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2011年03期

2 李萍;田方;宋琦;劉煥霞;李孟芳;魏丹;;新生牛血清對(duì)大鼠脂肪來(lái)源細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年04期

3 徐小春;李光早;;脂肪來(lái)源干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及成脂應(yīng)用進(jìn)展[J];中華全科醫(yī)學(xué);2012年05期

4 趙s罹，

本文編號(hào)：345585