發(fā)布時間：2017-05-04 18:17

  本文關(guān)鍵詞：脂肪來源干細胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細胞的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：涎腺的放射損傷常使其功能低下甚至喪失,引發(fā)一系列功能障礙。對于涎腺放射損傷,傳統(tǒng)的治療手段治療效果有限,不能從根本上解決問題。近年來,干細胞的研究逐漸深入,許多疾病的治療在未來成為可能,其中骨髓干細胞和脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在涎腺放射損傷中起到一定的改善功能的效果。我們前期研究發(fā)現(xiàn),ADSCs復(fù)合富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)可以在一定程度上改善放射損傷后涎腺的功能,并且較單純的ADSCs治療效果更好。但相關(guān)的作用機制尚不清楚,我們根據(jù)已有文獻報道,推測ADSCs之所以能修復(fù)涎腺放射損傷是因為其向涎腺腺泡樣細胞(salivary gland acinar-like cells,SGALCs)轉(zhuǎn)分化,并且PRF起到促進轉(zhuǎn)分化的作用。因此本實驗研究以體外涎腺細胞(salivary gland cells,SGCs)和ADSCs共培養(yǎng),并施加PRF干預(yù),驗證我們的猜想。目的探討ADSCs向SGALCs轉(zhuǎn)分化的可能性,并探究PRF在轉(zhuǎn)分化中的作用,為ADSCs復(fù)合PRF治療涎腺放射損傷提供理論依據(jù),同時為涎腺組織工程再生提供一種更合適的種子細胞。方法1.無菌切取C3H小鼠下頜下腺,分離培養(yǎng)下頜下腺細胞,觀察活細胞形態(tài),HE染色細胞形態(tài)及透射電鏡下腺泡細胞特有的酶原顆粒,并通過細胞角蛋白8(cytokeratin8,CK8)及波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色,α-淀粉酶免疫熒光染色及Western Blot從蛋白水平,通過CK8、vimentin、α-淀粉酶及水通道蛋白5(aquaporin-5,AQP-5)的m RNA RT-PCR檢測從基因水平鑒定細胞來源。2.無菌切取C3H小鼠腹股溝脂肪帶,分離培養(yǎng)ADSCs,觀察活細胞形態(tài),HE染色細胞形態(tài),MTT測定細胞生長曲線,流式檢測干細胞表面分子,成脂及成骨鑒定細胞干性。3.抽取兔耳中動脈血,離心制備PRF,將獲得的PRF凝膠凍干并研磨成顆粒,按25mg PRF顆粒/1ml無血清培養(yǎng)基的比例制備PRF浸提液,用ELISA檢測其體外釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor BB,PFGF-BB)的特點,并研究其對ADSCs增殖,遷移和骨向分化的影響。4.利用孔徑為0.4μm的Transwell小室放置于孔板中建立共培養(yǎng)系統(tǒng),實驗組將獲得的下頜下腺細胞培養(yǎng)在上層小室內(nèi),ADSCs培養(yǎng)在下層孔板中。對照組上層小室內(nèi)不含有下頜下腺細胞。在培養(yǎng)7天,14天和21天后,分別取對應(yīng)的實驗組和對照組,觀察ADSCs的形態(tài),通過α-淀粉酶,CK8及vimentin免疫熒光染色鑒定轉(zhuǎn)分化情況;通過α-淀粉酶免疫熒光染色計數(shù)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的細胞,計算轉(zhuǎn)分化率;最后通過α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR進一步鑒定轉(zhuǎn)分化情況。5.在ADSCs成骨誘導(dǎo)體系中加入不同濃度的PRF浸提液(0.5%,1%,3%,5%,7%,10%),誘導(dǎo)7天后檢測成骨相關(guān)基因堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型膠原(collagenⅠ,COLⅠ),runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor2,RUNX2)及骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)的表達,并于21天行茜素紅染色。此外,以共培養(yǎng)系統(tǒng)為基礎(chǔ),添加不同濃度的PRF浸提液(0.5%,1%和5%),共培養(yǎng)7天后,正常共培養(yǎng)組與不同濃度PRF浸提液組分別進行α-淀粉酶免疫熒光染色,計數(shù)陽性細胞,計算脂肪來源干細胞轉(zhuǎn)分化率,并進行統(tǒng)計學(xué)分析,以P0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。同時對不同濃度PRF浸提液組進行α-淀粉酶Western Blot及CK8,AQP-5,vimentin和α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析。結(jié)果1.成功培養(yǎng)具有良好功能的涎腺細胞:體外分離培養(yǎng)的小鼠下頜下腺細胞呈多邊形或卵圓形,密集排列時呈鋪路石樣;HE染色胞漿呈紅色,胞核呈藍色,基本位于細胞中央;透射電鏡觀察到胞漿內(nèi)存在黑色致密的顆粒,即為酶原顆粒;免疫熒光染色α-淀粉酶及CK8呈陽性,波形蛋白呈陰性;α-淀粉酶Western Blot顯示約53k Da處呈現(xiàn)特異性條帶;RT-PCR結(jié)果顯示下頜下腺細胞表達CK8、α-淀粉酶及AQP-5,不表達波形蛋白。2.成功培養(yǎng)功能良好的脂肪來源干細胞:體外分離培養(yǎng)的小鼠ADSCs呈長梭形,有胞突,密集排列時呈魚群樣。HE染色胞漿呈紅色,胞核成藍色。其生長曲線大致呈“S”型,與其他干細胞生長特點相似。ADSCs陽性表達干細胞表面標志物,并具備成脂成骨分化能力。3.富血小板纖維蛋白能持續(xù)釋放生長因子且一定劑量內(nèi)能促進脂肪來源干細胞的增殖和遷移:由兔耳中動脈血離心制備的PRF凝膠凍干后,可研磨成顆粒狀,其能持續(xù)釋放VEGF和PDGF-BB。不同濃度的PRF浸提液對ADSCs的生物學(xué)行為影響不同,其中以1%PRF浸提液組對ADSCs增殖和成骨分化具有較明顯的促進作用,以50%PRF浸提液組對ADSCs的遷移具有較明顯促進作用。4.脂肪來源干細胞能轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細胞:下頜下腺細胞誘導(dǎo)ADSCs發(fā)生轉(zhuǎn)分化,干細胞α-淀粉酶及CK8免疫熒光染色呈現(xiàn)陽性,第7天,14天,21天的轉(zhuǎn)分化率分別為:22.87±1.66%;40.56±1.74%;49.84±1.93%。轉(zhuǎn)分化后干細胞α-淀粉酶Western Blot顯示,第7天,14天,21天樣本在53k Da處出現(xiàn)條帶,其灰度值依次增高。α-淀粉酶,AQP-5及CK8 m RNA RT-PCR分析結(jié)果顯示三者m RNA含量在第7天,14天,21天依次增加,Vimentin m RNA表達量依次降低。對照組干細胞未發(fā)生轉(zhuǎn)分化。5.一定劑量的PRF能促進脂肪干細胞的轉(zhuǎn)分化:與正常成骨誘導(dǎo)相比,0.5%,1%,3%和5%PRF浸提液組的ALP,COLⅠ,RUNX2及OCN表達量較高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,這四組中茜素紅染色可見更多的礦化結(jié)節(jié)。共培養(yǎng)系統(tǒng)中,0.5%PRF浸提液組,1%PRF浸提液組和5%PRF浸提液組的干細胞7天轉(zhuǎn)分化率分別為30.39±1.51%,36.20±1.33%,28.78±0.83%。與正常共培養(yǎng)組相比,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)方差分析,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,且不同濃度PRF浸提液組之間比較,以1%PRF浸提液組轉(zhuǎn)分化率最高,與其他組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。α-淀粉酶Western Blot及α-淀粉酶m RNA RT-PCR分析顯示,PRF浸提液組與正常組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),不同濃度PRF浸提液組間比較,以1%PRF浸提液組表達量最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.成功分離培養(yǎng)小鼠下頜下腺細胞,呈多邊形,具有較強增殖能力,胞內(nèi)含有特異性酶原顆粒,能表達特異性的α-淀粉酶,為具備良好功能的涎腺細胞。2.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來源干細胞,長梭形,自我更新能力較強,干細胞表面標志性CD分子呈陽性,具有成脂成骨的分化潛能,為性能優(yōu)良的干細胞。3.富血小板纖維蛋白富含多種生長因子,在培養(yǎng)液中能穩(wěn)定且規(guī)律性的釋放血管內(nèi)皮生長因子和血小板衍生生長因子-BB。富血小板纖維蛋白浸提液能促進脂肪來源干細胞的增殖和遷移,呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。4.脂肪來源干細胞可以在體外轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細胞,且在一定時間內(nèi),隨著時間的延長,脂肪來源干細胞的轉(zhuǎn)分化率逐漸增加。5.在一定劑量范圍內(nèi)富血小板纖維蛋白能促進脂肪來源干細胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細胞。6.脂肪來源干細胞和富血小板纖維蛋白可以在一定程度上解決涎腺組織工程再生的種子細胞問題。
【關(guān)鍵詞】：涎腺細胞 脂肪來源干細胞 富血小板纖維蛋白 共培養(yǎng) 轉(zhuǎn)分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.55;R781.7
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-17
• 文獻回顧17-27
• 實驗一 C3H小鼠涎腺細胞的分離培養(yǎng)及鑒定27-39
• 1 材料27-28
• 2. 方法28-34
• 3. 結(jié)果34-37
• 4. 討論37-39
• 實驗二 C3H小鼠脂肪來源干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定39-47
• 1. 材料39-40
• 2. 方法40-42
• 3. 結(jié)果42-45
• 4. 討論45-47
• 實驗三 脂肪來源干細胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細胞的實驗研究47-56
• 1. 材料47-48
• 2. 方法48-49
• 3. 結(jié)果49-53
• 4. 討論53-56
• 實驗四 富血小板纖維蛋白的生物學(xué)特性及對脂肪來源干細胞生長增殖和遷移的影響56-67
• 1. 材料56-57
• 2. 方法57-61
• 3. 結(jié)果61-64
• 4. 討論64-67
• 實驗五 富血小板纖維蛋白對脂肪來源干細胞轉(zhuǎn)分化的影響67-77
• 1. 材料67
• 2. 方法67-69
• 3. 結(jié)果69-74
• 4. 討論74-77
• 小結(jié)77-78
• 參考文獻78-84
• 個人簡歷和研究成果84-85
• 致謝85

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙建輝;易成剛;郭樹忠;;脂肪來源干細胞的基礎(chǔ)研究進展[J];中國美容醫(yī)學(xué);2011年03期

2 李萍;田方;宋琦;劉煥霞;李孟芳;魏丹;;新生牛血清對大鼠脂肪來源細胞生長的影響[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年04期

3 徐小春;李光早;;脂肪來源干細胞的基礎(chǔ)研究及成脂應(yīng)用進展[J];中華全科醫(yī)學(xué);2012年05期

4 趙s罹，

本文編號：345585