本文關(guān)鍵詞：人類線粒體基因組CpG甲基化模式，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:我們?cè)谧罱囊豁?xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(DNA甲基化在鑒別同卵雙生個(gè)體中的研究,No.30973364)的研究中,發(fā)現(xiàn)人類血液樣本線粒體DNA控制區(qū)的一段序列甲基化水平為2%~34%,并在同卵雙生子(monozygotic twins,MZT)之間存在較大差異,可以鑒別多達(dá)31.93%的MZT,且具有明顯的組織差異性,其在唾液樣本中得甲基化程度幾近于0。這些結(jié)果引發(fā)了我們對(duì)于mt DNA甲基化這一研究領(lǐng)域的關(guān)注和思考。追蹤有關(guān)mt DNA甲基化研究的文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)該領(lǐng)域的研究較少,并且存在爭(zhēng)議。最早關(guān)于mt DNA甲基化的研究報(bào)道出現(xiàn)在30年前,Dawid對(duì)青蛙和Hela細(xì)胞的研究表明,二者均不存在mt DNA甲基化。之后有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠、倉(cāng)鼠、人類等種屬,應(yīng)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶分析均檢測(cè)到低水平的mt DNA甲基化。近來有研究報(bào)道m(xù)t DNA甲基化與多種疾病相關(guān),但也有報(bào)道認(rèn)為mt DNA幾乎沒有甲基化。這些存在矛盾的結(jié)果可能與mt DNA甲基化檢測(cè)的方法不同有關(guān)。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化焦磷酸測(cè)序技術(shù)是目前公認(rèn)的檢測(cè)DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn),能夠?qū)γ恳粋�(gè)Cp G位點(diǎn)進(jìn)行精確定量,并通過內(nèi)質(zhì)控監(jiān)測(cè)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率而具有較高的準(zhǔn)確性。綜上,本研究擬應(yīng)用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)線粒體甲基化進(jìn)行進(jìn)一步研究,將檢測(cè)覆蓋mt DNA控制區(qū)、13個(gè)蛋白質(zhì)基因、2個(gè)r RNA基因及22個(gè)t RNA基因的Cp G位點(diǎn)的甲基化情況,建立人類線粒體基因組DNA甲基化精確定量檢測(cè)方法,繪制一張較完整的人類線粒體基因組甲基化圖譜,為mt DNA甲基化遺傳標(biāo)記的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。方法:按照知情同意原則,采集健康個(gè)體外周血樣本154例,收集漱口水樣本24例,每位受試者均簽署知情同意書。對(duì)線粒體基因組Cp G位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)共有435個(gè)Cp G位點(diǎn)且分布不均勻,其中輕鏈復(fù)制起始點(diǎn)(OL)(5721~5798bp)處分布密度最高,t RNA基因分布密度最低。根據(jù)上述生物信息學(xué)分析結(jié)果,應(yīng)用Assay Design引物設(shè)計(jì)軟件分區(qū)段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物,本研究共設(shè)計(jì)20對(duì)擴(kuò)增引物及相應(yīng)的20條測(cè)序引物,可檢測(cè)20條序列共83個(gè)Cp G位點(diǎn)甲基化程度。20條序列依次命名為MT1~MT20。提取血液樣本及漱口水樣本的全基因組DNA,用Bam HⅠ處理DNA將mt DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開,進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。已轉(zhuǎn)化的DNA為模板,PCR擴(kuò)增20條特異性mt DNA序列,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序,獲得各Cp G位點(diǎn)的甲基化定量值。本實(shí)驗(yàn)通過MT1、MT2、MT3、MT4四條序列的分析比較開環(huán)組與未開環(huán)組檢測(cè)情況的差異。應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分析方法有:配對(duì)t檢驗(yàn)、方差分析、秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:1線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化焦磷酸測(cè)序的影響1.1.1線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)焦磷酸測(cè)序通過率的影響通過對(duì)65~154個(gè)血液樣本的檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)4條序列MT1、MT2、MT3、MT4在開環(huán)組的焦磷酸測(cè)序通過率分別為78.95%、97.32%、97.73%、90.26%,而在未開環(huán)組的通過率分別為80.95%、84.62%、64.52%、47.89%。除MT1外,其余3條序列的通過率在開環(huán)組與未開環(huán)組之間均具有顯著性差異,且未開環(huán)組的通過率均明顯低于開環(huán)組。進(jìn)一步分析測(cè)序失敗的原因,發(fā)現(xiàn)在未開環(huán)組,除MT2外,其余3條序列內(nèi)質(zhì)控不通過所占比例均達(dá)80%以上,而在開環(huán)組,測(cè)序失敗的主要原因是峰信號(hào)過低。表明在血液樣本中不開環(huán)對(duì)亞硫酸氫鹽的轉(zhuǎn)化有顯著影響,轉(zhuǎn)化效率明顯低于開環(huán)組,導(dǎo)致焦磷酸測(cè)序的通過率明顯降低。1.1.2漱口水樣本檢測(cè)的漱口水樣本數(shù)為14~24個(gè)。所檢測(cè)的4條序列MT1、MT2、MT3、MT4在開環(huán)組的焦磷酸測(cè)序通過率分別為87.50%、82.35%、94.12%、87.50%,而在未開環(huán)組的通過率分別為90.00%、87.50%、87.50%、94.44%,兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。漱口水樣本未開環(huán)組DNA的測(cè)序通過率明顯高于血液樣本未開環(huán)組,而且與對(duì)應(yīng)的開環(huán)組無顯著差異,而且在測(cè)序未通過的樣本中,并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化不完全導(dǎo)致的測(cè)序失敗,反而在開環(huán)組發(fā)現(xiàn)了兩例轉(zhuǎn)化不完全。該結(jié)果表明線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)漱口水樣本亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的影響較小。1.2線粒體DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)甲基化定量數(shù)值的影響1.2.1血液樣本在血液樣本中,雖然未開環(huán)組的測(cè)序通過率較低,但仍在47%以上,那么這些測(cè)序成功的樣本甲基化程度與開環(huán)組相比是否存在差異呢?我們對(duì)二者進(jìn)行了分析比較,發(fā)現(xiàn)4條序列在未開環(huán)組的平均甲基化程度分別為11.65%±0.29%,3.58%±0.27%,5.68%±0.20%,7.21%±0.27%,而在開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.16%±0.09%,1.68%±0.10%,0.32%±0.05%,0.78%±0.09%,Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明二者存在顯著差異,即開環(huán)組甲基化水平顯著低于未開環(huán)組,提示對(duì)于血液樣本線粒體DNA甲基化的檢測(cè),如果采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法,必須要先進(jìn)行開環(huán)處理,否則會(huì)過高地估計(jì)線粒體DNA甲基化水平。1.2.2漱口水樣本在漱口水樣本中,對(duì)開環(huán)組和未開環(huán)組檢測(cè)成功的樣本的甲基化程度進(jìn)行比較分析,4條序列在未開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.17%±0.25%,1.79%±0.35%,0.47%±0.17%,1.06%±0.28%,而在開環(huán)組的平均甲基化程度分別為1.38%±0.21%,2.14%±0.29%,0.69%±0.18%,0.93%±0.22%,Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明二者間的甲基化水平無明顯差異。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)漱口水樣本線粒體DNA的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)對(duì)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的影響較小,因此對(duì)甲基化定量數(shù)值的影響也不大,開環(huán)與否檢測(cè)結(jié)果無明顯差異。2人類線粒體基因組DNA甲基化譜分析應(yīng)用上述建立的Bam HⅠ處理及亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序方法檢測(cè)了14個(gè)無關(guān)個(gè)體血液樣本及漱口水樣本的線粒體基因組甲基化,包括D環(huán)區(qū)的16個(gè)Cp G位點(diǎn)、2個(gè)r RNA基因區(qū)的21個(gè)Cp G位點(diǎn)、6個(gè)蛋白質(zhì)基因的46個(gè)Cp G位點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論血液樣本還是漱口水樣本,無論D環(huán)區(qū)還是編碼區(qū),這些位點(diǎn)在14個(gè)樣本的平均甲基化水平為0%~6%,且大部分為0%~2%,意味著幾乎沒有甲基化的發(fā)生。結(jié)論:本研究首次采用亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)人類線粒體基因組DNA甲基化,發(fā)現(xiàn)mt DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)影響亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化效率,進(jìn)而影響后續(xù)的焦磷酸測(cè)序通過率,而且即使測(cè)序通過,其甲基化定量值明顯高于實(shí)際值,導(dǎo)致mt DNA甲基化程度被過高估計(jì)。這種現(xiàn)象在血液樣本表現(xiàn)突出,而在漱口水樣本卻未發(fā)生。應(yīng)用本研究建立的Bam HⅠ處理及亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序方法分析人類線粒體基因組83個(gè)Cp G位點(diǎn)甲基化,發(fā)現(xiàn)無論血液樣本還是漱口水樣本,無論D環(huán)區(qū)還是編碼區(qū),其平均甲基化水平均為0%~6%,意味著幾乎沒有甲基化的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：線粒體基因組 DNA甲基化 BamHⅠ 開環(huán) 不開環(huán) 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 焦磷酸測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-20
• 結(jié)果20-23
• 附圖23-31
• 附表31-45
• 討論45-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 綜述 線粒體DNA甲基化研究進(jìn)展51-61
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 致謝61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李明偉,鄒豐才,林瑞慶,朱興全;寄生性線蟲線粒體基因組研究進(jìn)展[J];寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào);2005年01期

2 劉祚昌,趙世民,詹慶才,陳一吾;水稻線粒體基因組翻譯產(chǎn)物與細(xì)胞質(zhì)雄性不育性[J];遺傳學(xué)報(bào);1989年01期

3 高翼之;王世浚;;人線粒體基因組的序列與結(jié)構(gòu)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1982年02期

4 Clarks A;鄭立紅;;線粒體基因組:缺失、疾病及進(jìn)化[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1992年01期

5 江莉;完整線粒體基因組鑒定細(xì)粒棘球絳蟲犬、馬株和犬、羊株的差別[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊(cè));2005年01期

6 李耀東;邵嘉會(huì);;線粒體基因組全序列研究與動(dòng)物分子系統(tǒng)發(fā)生的關(guān)系[J];青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年01期

7 譚圍;王中鐸;郭昱嵩;劉楚吾;劉筠;;孟加拉笛鯛線粒體基因組序列結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2009年03期

8 陳念;高慎淦;賴小平;劉鵬;王新;王羚酈;;藥用尖吻蝮蛇原動(dòng)物的線粒體基因組全序列分析[J];中藥材;2013年05期

9 熊偉;張海洋;楊紅娟;杜亞曼;;哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J];大理學(xué)院學(xué)報(bào);2014年08期

10 彭巧玲,蒲友光,王志方,聶劉旺;中華鱉線粒體基因組序列分析[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2005年05期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李博;劉剛;周立志;;禿鷲的線粒體基因組全序列研究[A];第十二屆全國(guó)鳥類學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第十屆海峽兩岸鳥類學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2013年

2 朱興全;李明偉;林瑞慶;趙光輝;張媛;劉國(guó)華;艾琳;蘇昂;李淳;袁子國(guó);;寄生蟲線粒體基因組學(xué)的研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲學(xué)分會(huì)第六次代表大會(huì)暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

3 涂四利;方偉武;蔡旭;;線粒體基因組中最長(zhǎng)保守序列的分析及其意義[A];中國(guó)運(yùn)籌學(xué)會(huì)第七屆學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集（中卷）[C];2004年

4 陳貴英;江建平;謝鋒;劉炯宇;鄭中華;;兩棲動(dòng)物線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征分析[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨青年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2007年

5 鐘金城;吳璽;;哺乳動(dòng)物線粒體基因組的聚類分析及其系統(tǒng)進(jìn)化研究[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

6 吳相云;李小玲;徐曉東;喻子牛;;14種牡蠣線粒體基因組演化模式與系統(tǒng)發(fā)育分析[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)·中國(guó)海洋湖沼學(xué)會(huì)貝類學(xué)分會(huì)第九次會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)討論會(huì)會(huì)議摘要集[C];2011年

7 馬俊業(yè);夏旭華;楊群;;普通海綿動(dòng)物線粒體基因組:表型特征與譜系年代分析[A];全國(guó)微體古生物學(xué)分會(huì)第九屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十四次學(xué)術(shù)年會(huì)、全國(guó)化石藻類專業(yè)委員會(huì)第七屆會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2012年

8 戚豫;張英;;臨床病例中線粒體基因組常見突變的篩查[A];遺傳學(xué)進(jìn)步與人口健康高峰論壇論文集[C];2007年

9 李明偉;林瑞慶;宋慧群;吳湘云;朱興全;;三種嚴(yán)重影響人和動(dòng)物健康的弓首蛔蟲線粒體基因組的研究[A];第二屆全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

10 張棋麟;袁明龍;;青海草原毛蟲全線粒體基因組序列測(cè)定與分析[A];“創(chuàng)新驅(qū)動(dòng)與現(xiàn)代植保”——中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨2013年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2013年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 記者 馬波;線粒體基因組的選擇壓力與動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力相關(guān)[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

2 本報(bào)記者 伍平;昆明動(dòng)物所:線粒體基因組的選擇壓力決定動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力[N];云南科技報(bào);2009年

3 麻建麗;像體檢一樣檢測(cè)基因[N];溫州日?qǐng)?bào);2008年

4 記者 施艷燕;治病像換輪胎一樣簡(jiǎn)單[N];蘇州日?qǐng)?bào);2011年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周志軍;五種螽囍線粒體基因組的測(cè)定與直翅目譜系基因組學(xué)分析[D];陜西師范大學(xué);2008年

2 申欣;軟甲綱動(dòng)物和星蟲動(dòng)物線粒體基因組特征及分子進(jìn)化研究[D];中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2008年

3 陳磊;狼腸道菌群生態(tài)及犬科線粒體基因組比較和系統(tǒng)發(fā)育[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

4 楊勁樹;海底熱液口甲殼類線粒體基因組及羅氏沼蝦生物鐘基因的分子解析與進(jìn)化分析[D];浙江大學(xué);2008年

5 張娟;單殖吸蟲線粒體基因組進(jìn)化生物學(xué)研究[D];中山大學(xué);2011年

6 曾慧花;四種蝗蟲線粒體基因組測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)生分析[D];陜西師范大學(xué);2013年

7 盧慧甍;霍山蹦蝗和意大利蝗全線粒體基因組的測(cè)序及分析[D];陜西師范大學(xué);2006年

8 田相軍;水稻線粒體基因組[D];浙江大學(xué);2006年

9 遠(yuǎn)洋;九種異齒亞綱貝類線粒體基因組研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2013年

10 劉忠權(quán);中國(guó)澤蛙線粒體基因組結(jié)構(gòu)及種群系統(tǒng)地理學(xué)研究[D];南京師范大學(xué);2003年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 胡曉笛;黑猩猩和大猩猩的比較線粒體基因組學(xué)研究[D];昆明理工大學(xué);2015年

2 劉寶靜;人類線粒體基因組CpG甲基化模式[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 郝婧;兩種螽斯線粒體全基因組序列測(cè)定及譜系基因組學(xué)分析[D];陜西師范大學(xué);2015年

4 陳亞莉;兩種蜻蜓全線粒體基因組的高通量測(cè)序及蜻蜓目系統(tǒng)發(fā)育分析[D];陜西師范大學(xué);2015年

5 宋晶睿;五種螟蛾線粒體基因組序列的測(cè)定及螟蛾總科系統(tǒng)發(fā)育研究[D];陜西師范大學(xué);2015年

6 周飛;四種蝗蟲線粒體基因組測(cè)定及直翅目系統(tǒng)發(fā)生分析[D];陜西師范大學(xué);2015年

7 張惠仙;兩種鱗翅目昆蟲線粒體基因組的測(cè)序與分析[D];浙江師范大學(xué);2015年

8 曹森楊;中華大蟾蜍和中國(guó)林蛙線粒體基因組全序列研究[D];安徽師范大學(xué);2007年

9 郭文英;蚜蟲代表物種的線粒體基因組研究[D];東北師范大學(xué);2011年

10 王曉明;海南兔的線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征與系統(tǒng)演化初探[D];山東大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：人類線粒體基因組CpG甲基化模式，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322010