本文關(guān)鍵詞：RCCS模擬微重力對小鼠肝Kupffer細胞影響的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的我國載人航天工程已處于關(guān)鍵時期,要實現(xiàn)長期駐留太空的目標,維持航天員的健康、安全和高效的工作能力至關(guān)重要。失重是制約人類長期駐留太空的主要因素,一方面失重使機體發(fā)生一系列生理病理變化,包括骨質(zhì)減少、肌肉萎縮、心血管紊亂和免疫功能低下等,另一方面失重會導致微生物生物學特性改變,多方面的因素增加了航天員患感染性疾病的風險。肝臟是人體重要的生化代謝、解毒和免疫器官,枯否細胞(Kupffer Cells,KCs)是肝臟的巨噬細胞,是全身單核-吞噬細胞系統(tǒng)的重要組成部分,具有吞噬、分泌和免疫功能,在全身尤其是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。模擬微重力條件下肝KCs的研究尚未見報道。本實驗采用RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotary Cell Culture System,RCCS)作為微重力模型,探討失重對肝臟KCs的影響,旨在為當前及今后載人航天飛行中出現(xiàn)的相關(guān)醫(yī)學問題提供對策思路和科學依據(jù)。研究方法采用RCCS培養(yǎng)系統(tǒng)建立小鼠肝KCs模擬微重力培養(yǎng)體系,將小鼠肝原代KCs隨機分為模擬微重力(simulated microgravity,SMG)組和正常重力(normal gravity,NG)組,SMG組旋轉(zhuǎn)器軸心與地面平行,NG組回轉(zhuǎn)器軸心與地面垂直。倒置相差顯微鏡下觀察小鼠肝KCs的形態(tài)和生長情況,于培養(yǎng)第3 d、5 d、7 d收獲細胞,血球計數(shù)板細胞計數(shù),流式細胞儀檢測小鼠肝KCs的細胞周期,qPCR和Western Blotting技術(shù)分別檢測小鼠肝KCs的PCNA、Ki-67、ERK、CDK2及Cyclin B基因和蛋白表達水平,掃描電鏡觀察小鼠肝KCs的表面結(jié)構(gòu),透射電鏡觀察小鼠肝KCs超微結(jié)構(gòu),激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠肝KCs細胞微絲骨架熒光強度的變化。結(jié)果細胞計數(shù)顯示,培養(yǎng)第3 d時SMG組明顯低于NG組(2.59±0.13 vs.3.10±0.15,p0.05),培養(yǎng)第5d、7d時smg組明顯高于ng組(6.92±0.35vs.5.87±0.17,p0.05;8.41±0.27vs.6.54±0.26,p0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng)第3d時smg組g0/g1期明顯高于ng組(78.10±0.22vs.59.69±1.19,p0.05),s期、g2/m期明顯低于ng組(11.97±0.43vs.27.63±0.88,p0.05;9.93±0.27vs.12.68±0.42,p0.05);培養(yǎng)第5d時,smg組g0/g1期低于ng組(69.52±1.48vs.74.83±0.66,p0.05),s期、g2/m期高于ng組(21.18±1.47vs.17.25±0.36,p0.05;9.30±0.37vs.7.92±0.38,p0.05);培養(yǎng)第7d時,smg組g0/g1期依然低于ng組(73.86±1.91vs.81.70±1.29,p0.05),s期、g2/m期亦高于ng組((18.88±1.94vs.12.07±0.84,p0.05;26±0.24vs.6.23±0.55,p0.05)。qpcr結(jié)果顯示,與ng組相比,smg組pcna、ki-67、erk、cdk2以及cyclinb基因表達在培養(yǎng)3d時均下調(diào),5d和7d時呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢。westernblotting檢測結(jié)果顯示,小鼠肝kcs培養(yǎng)3d時,與ng組相比較,smg組的pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表達量均較低(p0.05);細胞培養(yǎng)5d時,smg組的pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表達量高于ng組(p0.05);模擬微重力7d時,pcna、ki-67、p-erk、cdk2以及cyclinb1蛋白表達量進一步變化,蛋白表達量明顯高于ng組(p0.05)。掃描電鏡結(jié)果顯示,ng組和smg組的小鼠肝kcs貼附在微載體上,細胞呈橢圓形或圓形或梭形,細胞表面有很多細胞突起,細胞與細胞之間相互連接聚集成團,細胞伸出細細的偽足或傘形貼于微載體表面,隨著時間的延長,微載體上貼附的細胞逐漸增多,尤其是第7d微載體上的細胞最多,ng組與smg組細胞表面結(jié)構(gòu)無明顯差異。透射電鏡結(jié)果顯示,rccs模擬微重力培養(yǎng)小鼠肝kcs5d時,ng組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度擴張,線粒體固縮;smg組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微擴張外未見明顯異常;7d時,ng組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張更加明顯,部分細胞線粒體腫脹、空化;smg組粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張,線粒體出現(xiàn)固縮。激光共聚焦微絲熒光強度結(jié)果顯示,小鼠肝kcs培養(yǎng)第3d時,smg組的熒光強度相對于ng組較弱,隨著時間的延長,ng組和smg組的熒光強度均有所降低,ng組的熒光強度衰退相對于smg組明顯,在第5dsmg組的熒光強度高于ng組,至第7d時smg組的熒光強度明顯優(yōu)于ng組。結(jié)論在RCCS模擬失重應(yīng)激損傷期,小鼠肝KCs的增殖功能受到抑制,一定時相后其增殖能力在相關(guān)基因蛋白的參與調(diào)節(jié)下得以恢復并被激活強化。在模擬微重力條件下,小鼠肝KCs的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)亦發(fā)生變化。模擬微重力影響小鼠肝KCs增殖、形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的機制有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：模擬微重力 RCCS 肝臟 枯否細胞 增殖 超微結(jié)構(gòu)
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R852.22
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 小鼠肝Kupffer細胞RCCS微載體培養(yǎng)體系的建立15-24
• 引言15
• 材料與方法15-21
• 結(jié)果21-22
• 討論22-24
• 第二部分 RCCS模擬微重力對小鼠肝Kupffer細胞增殖影響的研究24-51
• 引言24
• 材料與方法24-34
• 結(jié)果34-48
• 討論48-51
• 第三部分 模擬微重力對小鼠肝Kupffer細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響51-59
• 引言51
• 材料與方法51-53
• 結(jié)果53-57
• 討論57-59
• 全文結(jié)論59-62
• 參考文獻62-66
• 個人簡歷66-67
• 致謝67-68
• 綜述68-79
• 參考文獻74-79

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