【摘要】：目的和意義:隨著微波技術(shù)的普及,其在生活、生產(chǎn)以及軍事中得到廣泛的應(yīng)用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)被公認(rèn)為是微波輻射的敏感靶部位之一,流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究均表明,微波輻射可導(dǎo)致腦電異常、睡眠障礙以及認(rèn)知功能的減退。海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要部位,突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)基礎(chǔ),樹(shù)突棘是構(gòu)成絕大多數(shù)興奮性突觸突觸后成分的結(jié)構(gòu)。SNK-SPAR途徑在由神經(jīng)元活化并誘導(dǎo)的突觸重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)神經(jīng)元受到刺激被活化后,SNK與SPAR被磷酸化并發(fā)生相互作用,進(jìn)而發(fā)生泛素化,并通過(guò)蛋白酶體途徑降解,導(dǎo)致PSD-95等突觸后腳手架蛋白丟失,最終使樹(shù)突棘從成熟的鈍圓形變成狹長(zhǎng)型。已有研究表明,微波輻射可致樹(shù)突棘可塑性異常,然而其機(jī)制鮮有報(bào)道,因此,本研究選擇以SNK-SPAR途徑為切入點(diǎn),旨在探討微波輻射導(dǎo)致樹(shù)突棘可塑性異常的機(jī)制,并為微波輻射所導(dǎo)致的腦損傷的防護(hù)和治療提供新的候選靶點(diǎn)。材料和方法:(1)采用參數(shù)為頻率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波照射Wistar大鼠,對(duì)照組與照射組各50只,照射共持續(xù)6周,每次6 min,每周3次。采用Morris水迷宮對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行空間學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè),于微波照射后1~5 d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn),于照射后14 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn);于輻射后6 h、7 d、14 d和28 d,采用高爾基染色法對(duì)海馬組織神經(jīng)元樹(shù)突棘形態(tài)和分布進(jìn)行檢測(cè);采用透射電鏡對(duì)海馬組織神經(jīng)元及樹(shù)突棘的超微結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行觀察;(2)采用Real time rt-PCR檢測(cè)大鼠海馬組織SNK mRNA表達(dá)水平的改變;采用Western-blot檢測(cè)大鼠海馬組織SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表達(dá)改變;采用免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)SPAR和PSD-95相互作用程度的變化;(3)采用參數(shù)為頻率2.856 GHz,平均功率密度30 mW/cm~2的微波輻射大鼠原代海馬神經(jīng)元,共照射3次,每次6 min,每次照射之間間隔6 min;于照射后0 h、6 h、1 d、2 d和3 d,采用CM-DiI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察輻射后神經(jīng)元樹(shù)突棘分布和形態(tài)的改變;采用HPLC檢測(cè)氨基酸遞質(zhì)釋放情況;采用Real time rt-PCR檢測(cè)大鼠原代海馬神經(jīng)元SNK mRNA水平的改變;采用Western-blot檢測(cè)大鼠原代海馬神經(jīng)元SNK-SPAR途徑主要分子:SNK、SPAR及PSD-95的蛋白表達(dá)改變,SNK-SPAR途徑上游分子CaN、CREB、p-CREB和NFATC4、p-NFATC4的表達(dá)改變,SNK下游Ras/Rap家族蛋白R(shí)asGRF1、RapGEF2和SynGAP表達(dá)的變化;采用免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)p-CREB在神經(jīng)元內(nèi)的定位和表達(dá)改變;采用免疫共沉淀及NanoLC MS/MS技術(shù)檢測(cè)照射后SNK和SPAR的磷酸化及泛素化水平的改變;(4)針對(duì)以上環(huán)節(jié)給予SNK抑制劑BI2536,檢測(cè)SNK及其下游蛋白表達(dá)的改變;給予CaN抑制劑FK506,檢測(cè)SNK mRNA水平、蛋白表達(dá)及其轉(zhuǎn)錄因子p-CREB表達(dá)改變,并同時(shí)檢測(cè)上述干預(yù)后神經(jīng)元樹(shù)突棘分布及形態(tài)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)微波輻射對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力、海馬組織樹(shù)突棘分布以及神經(jīng)元和樹(shù)突棘超微結(jié)構(gòu)的影響。(1)學(xué)習(xí)和記憶能力:在定位航行實(shí)驗(yàn)中,照射組大鼠平均逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組(p0.05或p0.01);空間探索實(shí)驗(yàn)中,照射組大鼠在目標(biāo)象限所用時(shí)間百分比和穿越平臺(tái)次數(shù)的平均值均顯著低于對(duì)照組(p0.05);(2)海馬組織神經(jīng)元樹(shù)突棘分布及形態(tài):大鼠海馬組織齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞樹(shù)突棘密度在照射后6 h、14 d和28 d顯著低于對(duì)照組(p0.05),錐體細(xì)胞內(nèi)蘑菇型樹(shù)突棘所占百分比在照射后28 d顯著低于對(duì)照組(p0.05);(3)大鼠海馬組織神經(jīng)元/樹(shù)突棘超微結(jié)構(gòu):照射組可見(jiàn)神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,線(xiàn)粒體腫脹空化,樹(shù)突棘微刺內(nèi)吞,突觸后致密物長(zhǎng)度及厚度相比對(duì)照組顯著降低(p0.05或p0.01);(2)微波輻射對(duì)大鼠海馬組織SNK-SPAR途徑相關(guān)分子的影響。(1)微波輻射后SNK mRNA水平在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)(p0.01);(2)SNK蛋白表達(dá)在照射后6 h降低(p0.01),14 d和28 d時(shí)升高(p0.05或p0.01),SPAR蛋白表達(dá)在照射后6 h和14 d顯著下調(diào)(p0.01),PSD-95在照射后28 d顯著降低(p0.05);(3)SPAR與PSD-95相互作用程度在照射后6 h和28 d時(shí)顯著降低(p0.05或p0.01);(3)微波輻射對(duì)大鼠原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘分布以及SNK-SPAR途徑及其上下游分子的影響。(1)微波照射后1d,大鼠原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘密度和成熟樹(shù)突棘百分比均顯著低于對(duì)照組(p0.05),照后3 d時(shí)恢復(fù);谷氨酸遞質(zhì)在照射后6 h和3 d顯著低于對(duì)照組(p0.01),甘氨酸除照射后6 h外其余各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(p0.05或p0.01);(2)大鼠原代海馬神經(jīng)元內(nèi)SNK mRNA在照射后即刻顯著降低,在6 h和1 d時(shí)顯著升高(p0.05);SNK蛋白表達(dá)在照射后即刻下降,照射后6 h和1 d升高(p0.05或p0.01);SPAR在照射后0 h~1 d時(shí)顯著降低(p0.05或p0.01),PSD-95在照射后6 h~1 d顯著低于對(duì)照組(p0.05或p0.01);(3)SPAR與PSD-95發(fā)生特異性結(jié)合的GKBD結(jié)構(gòu)域磷酸化位點(diǎn)由照射前的ser-1567和ser-1472轉(zhuǎn)變?yōu)檎丈浜蟮膕er-1603;與SNK和SPAR發(fā)生相互作用的泛素蛋白B在照射后均發(fā)生不同程度的升高;發(fā)現(xiàn)微波輻射可引起SPAR與MAP2的相互作用;(4)SNK下游Ras/Rap家族蛋白:微波輻射后0 h~1d,RapGEF2和SynGAP蛋白表達(dá)均顯著降低,RasGRF1僅在照射后0 h~6 h時(shí)顯著降低(p0.05或p0.01);(5)SNK上游分子:CaN在照射后0 h~3 d表達(dá)均顯著降低(p0.05或p0.01),p-CREB在核內(nèi)高表達(dá)并在照射后1 d顯著升高(p0.01),p-CREB在微波照射后1 d向神經(jīng)元核內(nèi)轉(zhuǎn)位,且較對(duì)照組相比表達(dá)升高(p0.05),p-NFATC4表達(dá)在核內(nèi)表達(dá)量極少,且漿蛋白內(nèi)p-NFATC4在微波照射前后無(wú)顯著差異;(4)微波輻射后大鼠原代海馬神經(jīng)元SNK-SPAR途徑干預(yù)實(shí)驗(yàn)。(1)在給予SNK抑制劑BI2536后,照射+BI2536組SNK蛋白表達(dá)較對(duì)照組及單純照射組顯著降低(p0.05或p0.01),照射+抑制劑組樹(shù)突棘密度顯著高于對(duì)照組及單純照射組(p0.05或p0.01),成熟樹(shù)突棘所占百分比顯著高于單純照射組(p0.05),與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;(2)在給予CaN抑制劑FK506后,照射+FK506組CaN蛋白表達(dá)較單純照射組顯著降低(p0.01)和p-CREB蛋白表達(dá)較單純照射組顯著升高(p0.05),SNK mRNA水平顯著高于單純照射組(p0.05),而其蛋白表達(dá)與單純照射組相比無(wú)顯著差異。結(jié)論:30 mW/cm~2微波輻射后:1.大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力降低;海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘分布發(fā)生改變,表現(xiàn)為樹(shù)突棘微刺內(nèi)吞,突觸后致密物厚度和長(zhǎng)度減少,齒狀回顆粒細(xì)胞樹(shù)突棘密度減少,CA區(qū)錐體細(xì)胞成熟樹(shù)突棘比例降低。2.SNK-SPAR途徑相關(guān)蛋白表達(dá)異常,SNK上調(diào)促使SPAR的降解和PSD-95丟失,使樹(shù)突棘成熟受阻,突觸連接弱化,大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。3.大鼠原代海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘密度和成熟樹(shù)突棘所占百分比減少;興奮性氨基酸遞質(zhì)釋放減少。4.大鼠原代海馬神經(jīng)元SNK-SPAR途徑穩(wěn)態(tài)破壞:CaN的低表達(dá)引起SNK轉(zhuǎn)錄因子p-CREB表達(dá)升高和核轉(zhuǎn)位,SNK mRNA水平顯著上調(diào),SNK蛋白表達(dá)升高,SNK和SPAR磷酸化、泛素化水平升高,SNK下游Ras/Rap家族蛋白表達(dá)失衡;5.SNK是微波輻射致樹(shù)突棘可塑性異常的有效作用靶點(diǎn);6.發(fā)現(xiàn)SPAR磷酸化位點(diǎn)改變可能是影響其與PSD-95作用的具體方式;MAP2與SPAR發(fā)生相互作用,為微波輻射致樹(shù)突棘可塑性異常的機(jī)制研究提供新思路。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R818
【圖文】：

差異性激活并導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死可能是微波輻射致認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制[12]。然而，對(duì)于微波輻射致樹(shù)突棘可塑性異常的機(jī)制研究目前尚鮮有報(bào)道。SNK-SPAR、Ephrin (Eph family receptor interating protein)/Eph、Neuregulin(NRG)/ErbB以及Wnt信號(hào)通路等均在調(diào)控樹(shù)突棘可塑性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Eph可啟動(dòng)新的突觸連接，對(duì)處于初期的突觸起到恢復(fù)和穩(wěn)定谷氨酸受體的作用還可以調(diào)節(jié)樹(shù)突棘的形態(tài)；又有研究表明，Ephrins的激活可誘導(dǎo)突觸的形成和形態(tài)變化，然而在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中Ephrin可調(diào)節(jié)突觸功能和長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)。Neuregulin/ErbB與精神分裂有關(guān)（表現(xiàn)為樹(shù)突棘數(shù)量減少），NRG1可增加皮層內(nèi)錐體細(xì)胞樹(shù)突棘數(shù)大小及密度，將ErbB4基因敲除后NRG1對(duì)樹(shù)突棘大小的作用受到抑制，但對(duì)其密度的作用未受影響。Wnt在調(diào)節(jié)成人神經(jīng)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，可控制神經(jīng)干細(xì)胞分化，樹(shù)突發(fā)育，神經(jīng)元可塑性以及軸突分枝[13-16]。血清誘導(dǎo)激酶( serum inducible kinase，SNK)與 樹(shù) 突 棘 相 關(guān) 的 Rap- 特 異 性 GTPase- 活 化 蛋 白 (spine-associated Rapguanosinetriphosphatase activating protein，SPAR) 所構(gòu)成的SNK-SPAR通路在神經(jīng)元活化后誘導(dǎo)的突觸重構(gòu)中起到關(guān)鍵作用。

圖 2 樹(shù)突棘內(nèi) SNK-SPAR 途徑示意圖（Wu LX, et al. Brain Res. 2007）鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin, CaN)，又稱(chēng)鈣神經(jīng)素，可對(duì)SNK的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖2）。CaN是一種可逆性去磷酸化的關(guān)鍵酶，鈣離子內(nèi)流后，它可能通過(guò)

樹(shù)突棘密度以 10 μm 為單位進(jìn)行拍攝及分析。采用 Image J 軟件分析神經(jīng)元高爾基染色結(jié)果mageJ 是一個(gè)基于 Java 的公共的圖像處理軟件，它能編輯、顯示、分析、保存和打印 8 位，16 位和 32 位的圖片，支持 TIFF，PNG，GIF，JPEG，DICOM，F(xiàn)ITS 等多種格式。1）首先，使用 Photoshop 打開(kāi)一張拍攝好的高爾基組織切片照片；2）依次點(diǎn)擊工具欄上的圖像→調(diào)整→黑白，調(diào)整黃色使之被“過(guò)濾”；3）依次點(diǎn)擊工具欄上的圖像→調(diào)整→曲線(xiàn)，拖動(dòng)曲線(xiàn)至適當(dāng)?shù)奈恢�，將調(diào)節(jié)到適合分析的狀態(tài)，另存圖片；4）用 Image J 軟件打開(kāi)圖片，首先設(shè)置標(biāo)尺：在圖片上畫(huà)一條與標(biāo)尺等長(zhǎng)，依次點(diǎn)擊工具欄上的 Analyze→Set Scale→Known Distance（填上數(shù)值）it of length（μm）→勾選 Global→OK；5）依次點(diǎn)擊工具欄上的 Plugins→Analyze→Cell Counter（圖 1-2）；

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2768486