【摘要】：自然界中有多種環(huán)境因子,如紫外線(xiàn)、電離輻射和化學(xué)試劑等都會(huì)導(dǎo)致DNA發(fā)生損傷,包括堿基損傷、DNA加合物、DNA雙鏈斷裂、DNA單鏈斷裂,最為嚴(yán)重的是DNA雙鏈斷裂(DSB),而電離輻射(IR)又是導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂的重要因素,當(dāng)使用IR誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DSB后,會(huì)有兩種主要修復(fù)方法介入DNA損傷修復(fù),劃分為:非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HR),NHEJ修復(fù)為易錯(cuò)修復(fù),而后者修復(fù)較為精確。DNA-PKcs是DNA雙鏈斷裂修復(fù)過(guò)程中非常重要的蛋白質(zhì)分子,它的翻譯后修飾對(duì)其活性起著決定性的作用,目前在蛋白質(zhì)翻譯后修飾領(lǐng)域中有很多種,多聚ADP核糖基化(PAR)修飾與乙�；揎椌褪瞧渲械膬煞N,其在染色質(zhì)重塑、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生中起著異常重要的作用。而且磷酸化也在DNA修復(fù)中起重要作用。目的:(1)研究DNA-PKcs的PAR修飾及其對(duì)DNA-PKcs功能和DNA損傷修復(fù)的影響。(2)探索DNA-PKcs的乙酰化修飾。方法:(1)通過(guò)將細(xì)胞進(jìn)行照射和未照射后,采用免疫共沉淀(Co-IP),免疫共聚焦熒光(IF),免疫印跡(western blot),以及流式細(xì)胞儀等技術(shù)手段檢測(cè)細(xì)胞DNA-PKcs的PAR修飾程度變化,不同周期DNA-PKcs的PAR修飾程度,應(yīng)用聚ADP核糖基化(PARP)抑制劑Olaparib后對(duì)于DNA-PKcs的影響以及對(duì)于修復(fù)通路選擇的影響,并研究其調(diào)節(jié)機(jī)制;細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Olaparib對(duì)于細(xì)胞的毒性作用,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)驗(yàn)證DMSO,Olaparib,Olaparib+DNA-PKcs抑制劑NU7441對(duì)于細(xì)胞的毒性作用;報(bào)告基因檢測(cè)Olaparib處置后對(duì)修復(fù)通路的選擇影響;單獨(dú)或組合使用Olaparib和NU7441后檢查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表達(dá);單獨(dú)或組合使用Olaparib和KU55933后檢查DNA-PKcs Ser2056,p-ATM的表達(dá)。(2)使用免疫共沉淀方法(Co-IP)驗(yàn)證DNA-PKcs的乙�；揎�,并且將其與未照射組比較,驗(yàn)證照射后不同時(shí)間的乙�；潭�;通過(guò)周期阻滯,驗(yàn)證不同周期DNA-PKcs的乙�；潭�;ASEB網(wǎng)站中利用Tip60序列及功能特性預(yù)測(cè)DNA-PKcs可能的乙�；稽c(diǎn);檢測(cè)DNA-PKcs截短體中乙�；l(fā)生的區(qū)段;質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)尋找DNA-PKcs可能的乙酰化位點(diǎn)。結(jié)果:(1照射后,DNA-PKcs發(fā)生PAR修飾,并且隨著照射劑量的增加,PAR修飾的程度會(huì)越來(lái)越高;Olaparib處理后,在10μM的濃度下,PAR修飾減少明顯;通過(guò)TDR周期阻滯后,顯示在S期PAR修飾最強(qiáng);Western和激光共聚焦顯示Olaparib處理細(xì)胞后激活DNA-PKcs的S2056位點(diǎn)磷酸化;激活NHEJ修復(fù)通路,而且增加細(xì)胞的放射敏感性;Olaparib處理增加了ATM磷酸化狀態(tài)。(2)DNA-PKcs能夠發(fā)生乙�；�,且在S期乙�；饔米顝�(qiáng),在照射后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),乙�；揎椧苍鰪�(qiáng);ASEB網(wǎng)站預(yù)測(cè)出乙�；稽c(diǎn)為:K1917、K3650、K4004;質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示乙�；稽c(diǎn)為K1870。結(jié)論:(1)DNA-PKcs能夠發(fā)生PAR修飾,并且PAR修飾隨著照射劑量的增加而增加,且在S期最明顯;Olaparib處置細(xì)胞后,激活DNA-PKcs和ATM活性;NHEJ修復(fù)通路激活;細(xì)胞的輻射敏感性增加。(2)DNA-PKcs可以發(fā)生乙�；�,隨照射后時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng),并且在S期最明顯;乙�；目赡苄揎椢稽c(diǎn)為:K1870、K1917、K3650、K4004。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R818
【圖文】：

DNA-PK 激酶發(fā)生活化，并且還在 DNA 雙鏈斷裂時(shí)調(diào)節(jié)自身的動(dòng)力學(xué)[5]。翻譯后修飾（Post-translational modifications ，PTMs)是蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)加工事件，其通過(guò)蛋白水解切割，或者通過(guò)向一個(gè)或者向多個(gè)氨基酸添加修飾基團(tuán)從而改變蛋白質(zhì)的特性。蛋白質(zhì)的 PTM 不僅僅是“裝潢”，還可以抉擇其活性狀況、定位、轉(zhuǎn)換和與其他蛋白質(zhì)的相互作用。例如，在信號(hào)傳導(dǎo)中，通過(guò)可逆添加和去除磷酸基團(tuán)來(lái)打開(kāi)和關(guān)閉激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)[7]，并且在細(xì)胞周期中，蛋白質(zhì)泛素化標(biāo)記細(xì)胞周期蛋白在特定的時(shí)間點(diǎn)被破壞[8]。我們都知道人體中的氨基酸僅僅 20 種，能夠合成的蛋白質(zhì)也很少，所以要想滿(mǎn)足機(jī)體的多種多樣的功能，只有通過(guò)翻譯后修飾才能達(dá)到此目的（圖 1.2）。眾所周知，PTM 如泛素化，去泛素化（neddylation），乙�；秃颂腔≒arylation）等是調(diào)節(jié)細(xì)胞許多代謝過(guò)程的重要機(jī)制（圖 1.1）。在我們的基因組中有許多的基因，通過(guò)基因的可變剪切、mRNA 編輯和可變啟動(dòng)子，就會(huì)形成大量轉(zhuǎn)錄基因組，通過(guò)翻譯后修飾，就會(huì)產(chǎn)生超過(guò)約 1,000,000 的蛋白質(zhì)，從而行使不同的功能。

圖 1.2 蛋白組復(fù)雜性（引自北京百泰派克生物）聚（ADP-核糖基化），在 DNA 修復(fù)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞死亡凋亡中起關(guān)。自 1963 年以來(lái)已發(fā)現(xiàn)聚（ADP-核糖基化）反應(yīng)已有 55 年，其發(fā)生 PA的氨基酸為絲氨酸。其中新的 DNA 依賴(lài)性聚腺苷酸（PAR）由 PARP 和單核苷酸（NAD）合成，PARG 水解 PAR[9,10]。將細(xì)胞置于電離輻射，自烷化劑等的環(huán)境后，PARP迅速與 DNA鏈斷裂區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致PAR 修飾，NA

PARP的激活導(dǎo)致細(xì)胞PAR的大量增加，其被PARG快速分解代謝[20,21]，但是完全逆轉(zhuǎn)需要TARG[22]或MacroD1 / 2活性[23-25]。 PARylation在DNA損傷反應(yīng)中的作用可分為三個(gè)類(lèi)別：松散染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，PAR結(jié)合因子的募集和/或修飾以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[26]。染色質(zhì)相關(guān)蛋白（包括組蛋白和PARP1本身）的PAR修飾促進(jìn)了染色質(zhì)松散，從而導(dǎo)致它們從DNA解離。 PAR結(jié)合因子主要通過(guò)四類(lèi)PAR結(jié)合結(jié)構(gòu)域之一募集：PAR結(jié)合基序（PBM），PAR結(jié)合鋅指（PBZ），macrodomain和WWE結(jié)構(gòu)域[27]。一些（例如ALC1，APLF，ISWI）參與染色質(zhì)的重塑[28,29]。其他參與DNA修復(fù)（例如XRCC1，DNApol-β，MRN復(fù)合物，Topo I）[17,30-31]或廣義DDR信號(hào)傳導(dǎo)（例如p53）[32,33]。最后，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)主要涉及募集或修飾參與轉(zhuǎn)錄沉默的蛋白質(zhì)（例如CHD4，PcG蛋白和FACT復(fù)合物）[34-36]，PAR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活也發(fā)生在NFκB介導(dǎo)的炎癥信號(hào)傳導(dǎo)中[37]。然而，過(guò)度PARylation會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這樣有助于通過(guò)犧牲嚴(yán)重受損細(xì)胞來(lái)維持生物體的基因組完整性[38]。

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本文編號(hào)：2768049