【摘要】：研究背景:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)是硫酸類肝素蛋白聚糖家族中的一員,特異性的高表達在80%以上的人肝癌組織中,而非肝癌組織不表達。L5(序列為RLNVGGTYFLTTRQ)是韓國學(xué)者Lee等經(jīng)噬菌體展示及轉(zhuǎn)染技術(shù)篩選出來的GPC3受體的特異靶向多肽。近幾年,我們研究團隊開發(fā)了 18F標(biāo)記的L5顯像劑用于荷瘤裸鼠HCC成像,然而,肝臟及腸道聚集了大量的放射性顯像劑,其圖像質(zhì)量并不是很好,不利于肝臟和腹部腫瘤的顯像。為了提高顯像效果,我們在前期研究的基礎(chǔ)上,對NOTA-L5進行修飾,在靶向多肽NOTA-L5的-NH2端增加了親水基團GGGRDN(簡稱L),制備了 18F標(biāo)記的18F-AlF-NOTA-L-L5,期望親水基團的引入能提高探針的水溶性,減少肝膽排泄,降低肝臟和腸道的放射性背景,更有利于肝細胞癌的顯像。研究目的:1.通過將GGGRDN(L)的親水性基團修飾NOTA-L5多肽并使用18F-AlF螯合法進行放射性標(biāo)記開發(fā)新型的GPC3靶向PET探針(18F-AlF-NOTA-L-L5)。2.與18F-AlF-NOTA-L5進行比較,探索親水基團L的引入后的靶向探針18F-AlF-NOTA-L-L5能否減少肝膽排泄,降低肝和腸中的背景放射性,提高腫瘤顯像效果。研究方法:1.合成L5、L-L5、NOTA-L5及NOTA-L-L5,并對多肽進行分離純化及分析鑒定。2.用表面等離子共振(SPR)測量來確定NOTA-L5和NOTA-L-L5對GPC3蛋白的親和力。3.采用手動和模塊化通過18F-AlF螯合法標(biāo)記得到放射性標(biāo)記探針18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5,并測定各自的標(biāo)記率和放化純度。4.用HPLC對18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5放射性藥物進行體外穩(wěn)定性實驗,使用Y計數(shù)器對上述放射性藥物進行體內(nèi)穩(wěn)定性實驗及脂水分配系數(shù)實驗。5.體外細胞攝取及流出實驗用于評價18F-AlF-NOTA-L5和18F-AlF-NOTA-L-L5與受體GPC3的結(jié)合特性。6.建立HepG2及RH7777裸鼠腫瘤模型,經(jīng)尾靜脈注射18F-AlF-NOTA-L5或18F-AlF-NOTA-L-L5,并研究該腫瘤模型的microPET/CT顯像及裸鼠的體內(nèi)分布。7.通過對HepG2及RH7777腫瘤組織行免疫病理檢查確認其GPC3表達。結(jié)果:1.合成多肽L5、L-L5、NOTA-L5和NOTA-L-L5,純度均大于95%。質(zhì)譜分析主峰分子量與理論分子量相符,滿足實驗要求。2.親和力實驗:用表面等離子體共振(SPR)測定法測定NOTA-L5和NOTA-L-L5與GPC3結(jié)合能力,結(jié)果顯示:NOTA-L5和NOTA-L-L5的解離常數(shù)(KD)分別為1.01×10-7和6.33×10-8mol。兩者的Kd都在納摩爾級別,提示親水基團修飾對親和力無明顯影響。3.18F-AlF-NOTA-L5 和18F-AlF-NOTA-L-L5 合成產(chǎn)率分別為 79.98±8.04%和54.81±9.05%,18F-AlF-NOTA-L-L5 標(biāo)記產(chǎn)率低于 18F-AlF-NOTA-L5(P0.05)。經(jīng)C18柱純化后其放化純度分別為97.17±1.03%和100±0%,兩者的放化純度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。產(chǎn)物峰單一,與未標(biāo)記前的多肽出峰位置基本相同。4.穩(wěn)定性試驗:18F-AlF-NOTA-L5在37℃ PBS及血清中的放化純度均大于94%,18F-AlF-NOTA-L-L5在37℃ PBS及血清中的放化純度均大于98%,18F-AlF-NOTA-L-L5 體外穩(wěn)定性優(yōu)于 18F-AlF-NOTA-L5(P0.05)。在注射18F-AlF-NOTA-L5 60 分鐘后,18F-AlF-NOTA-L5 及 18F-AlF-NOTA-L-L5 的體內(nèi)穩(wěn)定未見明顯差異(P0.05)。5.脂水分配實驗:經(jīng)實驗測定18F-AlF-NOTA-L5的Log P=-2.10±0.07,18F-AlF-NOTA-L-L5的Log P=-2.42±0.09,兩者之間的統(tǒng)計學(xué)分析表明18F-AlF-NOTA-L-L5 分子探針親水性比 18F-AlF-NOTA-L5 好(t=5.482,P=0.002,n=4)。6.體外細胞攝取實驗:HepG2細胞攝取18F-AlF-NOTA-L-L5及18F-AlF-NOTA-L5兩種示蹤劑曲線相似,HepG2細胞攝取18F-AlF-NOTA-L-L5稍高于18F-AlF-NOTA-L5,但是兩者差別不大。HepG2細胞攝取18F-AlF-NOTA-L5及18F-AlF-NOTA-L-L5明顯高于GPC3陰性的RH7777細胞。HepG2細胞與兩種放射性藥物共同孵育30min后,HepG2細胞結(jié)合放射活性接近高峰,并達到平臺期。7.micro PET/CT 顯像:注射 18F-AlF-NOTA-L5 或 18F-AlF-NOTA-L-L5 后,18F-AlF-NOTA-L-L5 的 HepG2 腫瘤攝取顯著高于 18F-AlF-NOTA-L5(30min:3.10±0.26vs2.28±0.33,t=3.935,P = 0.008;60min:3.27±0.34vs1.90±0.65,t =3.757,P = 0.016),120min 18F-AlF-NOTA-L-L5 腫瘤攝取為 1.35±0.17%ID/g 稍高于18F-AlF-NOTA-L5 腫瘤攝取(1.08±0.73%ID/g),差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.730,P=0.493)。注射18F-AlF-NOTA-L-L5 30min、60min及120min后,不表達GPC3 RH7777腫瘤幾乎不攝取,HepG2腫瘤攝取在不同時間的均顯著高于RH7777腫瘤攝取(30min:3.10±0.26vs1.75±0.04,t =10.308,P=0.002;60min:3.27±0.34vs1.63±0.03,t =9.639,P = 0.002;120min:1.35±0.17vs0.66-±0.05,t =7.693,P = 0.003)。18F-AlF-NOTA-L5 在 30min、60min、120min 肝臟攝取值高于18F-AlF-NOTA-L-L5 肝臟攝取值,并且 30 及 60min 18F-AlF-NOTA-L-L5 肝臟攝取值顯著低于18F-AlF-NOTA-L5肝臟攝取,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(30min:6.35±2.54vs1.93±0.39,t=3.449,P=0.038;60min:4.32±1.49vs1.85±0.37,t=3.232,P=0.041;120min:2.30±0.21v51.23±0.43,t=2.118,P=0.079)。18F-AlF-NOTA-L-L5的腎臟攝取值都明顯高于18F-AlF-NOTA-L5的腎臟攝取值,差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(30min:37.55±3.79vs12.83±1.65,t=6.426,P= 0.001;60min:35.9±2.56vs8.70±1.70,t =11.798,P = 0.000;120min:31.86±3.8vs2.57±0.17,t=4.224,P = 0.006)。對不同時間點的不同臟器進行了腫瘤/非腫瘤放射性比值分析,結(jié)果顯示:在HepG2裸鼠腫瘤模型中,18F-AlF-NOTA-L-L5的腫瘤/肝臟攝取比值在30min、60min及120min都高于18F-AlF-NOTA-L5的腫瘤/肝臟攝取比值,差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(30min:1.65±0.28vs0.39±0.11,t =8.314,P = 0.000;60min:1.82±0.38vs0.48±0.23,t =6.068,P = 0.001;120min:1.17±0.31vs0.49±0.39,t =2.740,P=0.034)。注射靶向分子探針后,18F-AlF-NOTA-L-L5在30min及60min具有比18F-AlF-NOTA-L5更高腫瘤/腸道,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(30min:2.70±1.19vs0.64±0.35,t =3.324,P = 0.016;60min:2.74±0.44vs0.71±0.53,t =5.863,P = 0.001;120min:3.45±2.15vs0.39±0.19,t=2.842,P = 0.064)。體外生物學(xué)分布實驗結(jié)果與小動物microPET結(jié)果相似。8.免疫組化結(jié)果顯示GPC3在HepG2腫瘤組織高表達,在RH7777腫瘤組織中不表達。結(jié)論1.本研究通過 A118F 螯合法成功制備了 18F-AlF-NOTA-L5 和 18F-AlF-NOTA-L-L5,其放化純達97%以上。此A118F-NOTA螫合化學(xué)方法簡便、省時,可通過“一鍋法”標(biāo)記完成,并同時能進行模塊式自動化生產(chǎn),為臨床大批量生產(chǎn)提供可能。此實驗表明:親水基團修飾NOTA-L5肽后,18F-AlF-NOTA-L-L5放射性標(biāo)記效率低于18F-AlF-NOTA-L5放射性標(biāo)記效率,但是其放化純度高于18F-AlF-NOTA-L5。2.以上實驗證明:增加親水基團GGGRDN后,不影響18F-AlF-NOTA-L-L5與GPC3結(jié)合能力,不影響18F-AlF-NOTA-L-L5體內(nèi)外穩(wěn)定性,且其親水性明顯提高。3.體外細胞攝取實驗表明18F-AlF-NOTA-L-L5攝取均符合受體-配體競爭結(jié)合規(guī)律。4.經(jīng)microPET/CT和體內(nèi)放射性分布研究證實引入親水基團后,腫瘤攝取提高了,肝膽排泄明顯降低,腎臟攝取明顯增高,腫瘤/肝比值明顯增高,有利于肝細胞癌的顯像。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R817
【圖文】：

３．２邋ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５的合成方法學(xué)逡逑３．２．１邐ＮＯＴＡ－Ｌ５和ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５通過ｐ－ＮＣＳ－Ｂｎ－ＮＯＴＡ經(jīng)由硫脲鍵與肽的胺基連逡逑接（圖３－１）。逡逑Ｌ邋，．．一ｆ邋ｓ邐肽鏈逡逑》ｃ４ｓ邐Ｉｆ邋＇邋kw邐＾邋Ｈ逡逑°邐丨加熱逡逑邐邐邐邐逡逑ｆＸ邋Ａ邐，佊佊二／ ？？0＊逡逑＇ＮＨ邋加熱邐、邐ｓ３＾0逡逑ｄ＾－Ｒ邋＾邐＞＝＼逡逑＼１邋Ｈ逡逑苯乙內(nèi)酸硫佭逡逑（ＰＴＨ邋｝邐ｋ＾Ｊ逡逑圖３－１邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ５和Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５合成化學(xué)方程式。逡逑Ｆｉｇ邋３－１ＮＯＴＡ－Ｌ５邋ａｎｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｅｑｕａｔｉｏｎ．逡逑３．２．２邐ＮＯＴＡ－Ｌ５邋的合成逡逑準(zhǔn)備兩個１．５ｍｌ的編號分別為Ａ、Ｂ的離心管。用精密天平稱�。常罚恚缍嚯腻义希蹋笛b至Ａ管，并加２００ｕｌ的硼酸緩沖液，超聲震蕩２分鐘。稱�。玻埃恚珏义希穑危茫樱拢睿危希裕裂b至Ｂ管，溶解于ｌＯＯｕｌ邋ＤＭＳＯ，超聲震蕩２分鐘。Ａ管及Ｂ逡逑管混合，將混合物的ｐＨ調(diào)節(jié)至９．０，在室溫下超聲２小時后，反應(yīng)被淬滅。反逡逑應(yīng)后�。担酰鞓悠罚褂梅治鲂停龋校蹋脕龛b定所需產(chǎn)物。分析型ＨＰＬＣ在Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ逡逑Ｌｕｎａ邋Ｃｉ８反相分析柱（５ｊａｍ，２５0ｘ４．６ｍｍ）上的參數(shù)為：流速為ｌｍＬ邋／邋ｍｉｎ，Ａ逡逑相為含０．１邋％三氟乙酸的水溶液、Ｂ相為含０．１邋％三氟乙酸的乙腈溶液

圖３－２邋１８Ｆ標(biāo)記Ｎ０ＴＡ－Ｌ５及Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５反應(yīng)流程圖。逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋１８Ｆ邋ｌａｂｅｌｅｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ５邋ａｎｄ邋Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｃｈｅｍｅ0逡逑３．４．３半自動化模塊１８Ｆ－Ａ１Ｆ螯合法ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５逡逑Ｉ８Ｆ標(biāo)記Ｎ０ＴＡ－Ｌ５及Ｎ０ＴＡ－Ｌ－Ｌ５在氟多功能模塊（如下圖）半自動合成。逡逑１）Ｃ１８柱的活化：使用注射器抽取無水乙醇１０ｍｌ，將Ｃ１８柱與注射器連接，推動逡逑注射器使無水乙醇通過Ｃｉ８柱，隨后打入空氣使Ｃｉ８柱干燥，另用注射器抽�。保埃恚戾义霞兯ㄟ^Ｃ１８柱，隨后打入空氣使其千燥，完成活化。２）模塊的清洗：首先檢逡逑查設(shè)備中的各個部件的功能狀態(tài)，如密封性，濾片的過濾功能，管線是否完好逡逑及無折疊，氣密性是否良好等。然后依次向試劑瓶１－６號瓶中先后加入５ｍｌ水，逡逑１７逡逑

質(zhì)譜分析鑒定，ＮＯＴＡ邋－Ｌ５的主峰分子量（ｍ／ｚ，邋Ｄａ）為２０７６．３和２６３２．８，逡逑與ＮＯＴＡ邋－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５理論分子量２０７６．３７和２６３２．９１相符，證明標(biāo)記合成逡逑（圖５－３）。經(jīng)ＨＰＬＣ純化、分析結(jié)果顯示，ＮＯＴＡ－Ｌ５及ＮＯＴＡ－Ｌ－Ｌ５標(biāo)記多肽主逡逑峰明確，對稱性良好，主峰保留時間分別為１４．５３３和１３．４７３ｍｉｎ。ＮＯＴＡ－Ｌ５的逡逑純度為９６．２９％和９５．９７％邋（圖５－４）。驗證合格后將產(chǎn)物分裝入２５０＾ｇ／管，清楚標(biāo)逡逑識后放入－８０°Ｃ冰箱中存放。逡逑ｆ邐邐邋邐［苜邐邐逡逑Ｉ邋５Ｊｓ，邐Ａ邋！郵邐ＳｆＳ邐Ｂ逡逑Ｉ邋５Ｊ邐卜叫逡逑Ｉ邐！逡逑Ｍ邐ｊ邋Ｉ）逡逑ｆ邐Ｉ逡逑Ｈ邐Ｉ邋—逡逑ｉ邐ｆ邐Ｍｉ？｜邐：邐Ｉ逡逑１邐叫逡逑ａＳ．４ｐＨｒ．ＩＭｆ邐Ｕｔ／ｉ邐ｉ邐｜逡逑Ｓ２＊１‘邐ｉ邐丨邋‘邐｜邋ｉ逡逑Ｉｓ邐｜邐！邐ｉｓ逡逑Ｉ邐ｋ＾＼邐ｉ邐ｉ邐｜逡逑��！邐丨邐潔ｗ逡逑！邐卜逡逑；邐Ｉ邐Ｉ邐｜邐ｉ邐ｉ逡逑；Ｈ邐丨邐丨心逡逑Ｉ邐叫邋｜邐ｊ邐＾臂逡逑，鱸邐ｊ邐｜邋Ｕｒｆ｜逡逑Ｉ邐Ｉ邐丨逡逑卜？．邐？被邐Ｈ邐ｊ邐Ｉ逡逑Ｉ邐＼邐ｍｉ邐＼逡逑Ｉ邋＾邐＾邋｜邋ｊ邋＾邐ｊ邐Ｌｉ邐＾邋＾逡逑■．＾３？邐ｔ＆ｔ７ｊｉｇ：－ａｉ－：邋ｃ邋＾，ｉＴ？？邐ｊ邋ｊｇ；邐＾邋ｍ邐ｓａ＞邐？ｍｎｇａ邋ｉ逡逑＂￥ｃ邐？？銥邋ｉ？邋滾邋_炲迕藉澹觶澹潁澹礤澹潁椋簀澹蓿螅澹幔徨澹

本文編號：2766230