【摘要】：目的:磷化物主要包括磷化鋅、磷化鋁、磷化鈣和磷化鎂,農(nóng)業(yè)領(lǐng)域常用于保護(hù)食品不受嚙齒類動(dòng)物和昆蟲(chóng)的侵害,也用于列車車廂、船艙和儲(chǔ)存庫(kù)的熏蒸消毒,是全球最普遍的殺鼠、殺蟲(chóng)劑。工業(yè)領(lǐng)域則用于石油添加劑、阻燃劑和有機(jī)磷化工合成以及半導(dǎo)體制造中硅晶體的涂層。磷化物遇水或酸可以產(chǎn)生無(wú)色稍有魚(yú)腥臭味的高毒類磷化氫氣體,口服無(wú)機(jī)磷化物或誤吸磷化氫中毒致死事件在國(guó)內(nèi)外時(shí)有發(fā)生。由于磷化氫中毒的毒理作用機(jī)制尚未完全被闡明,中毒后主要組織病理學(xué)變化多樣,缺乏典型組織病理學(xué)改變,以及不屬于常規(guī)毒物篩查范圍,對(duì)于磷化物中毒致死案例的死因鑒定一直是法醫(yī)學(xué)鑒定的難點(diǎn)。法醫(yī)學(xué)對(duì)于磷化物中毒的檢測(cè)和組織病理學(xué)觀察方面所作的基礎(chǔ)研究探索工作甚少,本研究通過(guò)建立大鼠急性磷化鋁中毒灌胃模型,采用法醫(yī)學(xué)經(jīng)典磷化氫二乙基二硫代氨基甲酸銀(Ag-DDC)比色法對(duì)染毒大鼠組織器官進(jìn)行中毒檢測(cè),借鑒其他學(xué)科有關(guān)磷化氫鉬藍(lán)比色法檢測(cè)方法原理將其引入并對(duì)比法醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法,探索和優(yōu)化常見(jiàn)生物檢材中磷化氫檢測(cè)分析方法,豐富法醫(yī)學(xué)磷化氫檢測(cè)研究。同時(shí)對(duì)染毒大鼠器官組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,研究磷化鋁灌胃中毒模式下器官組織病理形態(tài)學(xué)改變,尋找較典型的組織病理形態(tài)學(xué)改變,進(jìn)一步探討磷化氫中毒的毒理作用機(jī)制。方法:1.選用健康清潔雄性SD大鼠24只,由河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,體重(270±40)g。實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食,24只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(12只)和對(duì)照組(12只)。實(shí)驗(yàn)組以食用油包裹碾成粉末狀磷化鋁6LD_(50)(6×11.59mg/kg)經(jīng)口進(jìn)行灌胃,觀察記錄中毒癥狀,死亡時(shí)間。對(duì)照組灌服等量食用油,觀察24h無(wú)明顯癥狀變化后頸椎脫臼處死,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的呼吸和心跳等生命體征全部消失時(shí),迅速解剖動(dòng)物,取大鼠部分肺、肝、腎、肌肉、睪丸等經(jīng)福爾馬林固定后,HE染色制片觀察;另取心血、心臟、肺、肝、脾、腎、腦、胃及胃內(nèi)容物密封袋密封置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢。2.健康清潔雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量(250±30)g,由河南科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組各10只,分籠飼養(yǎng)。各組大鼠實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后先將磷化鋁片劑裝入密封袋中敲打碾磨成細(xì)粉狀,大鼠稱重后按照文獻(xiàn)所報(bào)道的大鼠口服磷化鋁灌胃LD_(50)為11.59 mg/kg進(jìn)行給藥量計(jì)算,實(shí)驗(yàn)組大鼠分別以5ml食用油包裹碾成粉末狀的磷化鋁經(jīng)口一次性灌服0.5、1.0和2.0倍LD_(50)劑量,對(duì)照組大鼠則灌服5ml等體積食用油。觀察大鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)干預(yù)后的行為表現(xiàn),記錄各組大鼠死亡時(shí)間及數(shù)量,未死亡大鼠連續(xù)觀察14 d后頸椎脫臼法處死。取肺、肝、腎、脾、心臟、腦、睪丸、肌肉、喉頭、氣管、胃及胃內(nèi)容物組織,經(jīng)固定、漂洗、后固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色等處理,光鏡觀察并顯微照相。結(jié)果:1.鉬藍(lán)比色法檢測(cè)生物檢材中的磷化氫,在5~25μg范圍內(nèi)可用于定量檢測(cè),檢出限為1.8μg,回收率78.00±2.83~92.68±2.28%,方法精密度達(dá)1.47~4.69%。傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)Ag-DDC比色法在10~45μg范圍內(nèi)可用于生物檢材中的磷化氫定量檢測(cè),檢出限為10μg。2.鉬藍(lán)比色法檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)法醫(yī)學(xué)Ag-DDC比色法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)兩種方法對(duì)于心血、胃及胃內(nèi)容物檢出定量結(jié)果無(wú)顯著性差別(P0.05),肺、肝、脾、腎、腦組織中均可檢出磷化氫但不能進(jìn)行定量,心臟中均未檢出磷化氫。3.急性大鼠磷化鋁灌胃染毒后四組大鼠的死亡率隨著染毒劑量的增加而升高(P0.05)。大鼠染毒后平均死亡時(shí)間隨著染毒劑量的增加而減小(P0.05),但減小幅度在逐漸趨于穩(wěn)定。4.光鏡觀察結(jié)果:0.5倍LD_(50)死亡組肺組織肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)彌漫性出血,肺泡壁毛細(xì)血管及肺內(nèi)小動(dòng)脈擴(kuò)張、充血明顯,間質(zhì)上皮細(xì)胞增生,肺泡間隔明顯增寬;0.5倍LD_(50)未死亡組肺組織肺泡腔內(nèi)彌漫性出血現(xiàn)象消失,肺泡壁毛細(xì)血管及肺內(nèi)小動(dòng)脈擴(kuò)張、充血現(xiàn)象消失或不明顯,間質(zhì)上皮細(xì)胞增生,肺泡間隔增寬;1.0倍LD_(50)組肺組織局部肺泡壁斷裂、融合,肺內(nèi)小血管及間質(zhì)毛細(xì)血管充血、擴(kuò)張,肺泡間隔稍增厚;2.0倍LD_(50)組肺組織可見(jiàn)局部肺泡壁斷裂、融合,肺內(nèi)小血管及間質(zhì)毛細(xì)血管輕度充血、擴(kuò)張,肺泡間隔略增厚;肝細(xì)胞脂肪變性,散在灶性水樣變性及點(diǎn)灶性壞死,局部肝門(mén)管區(qū)可見(jiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);腦組織水腫,腦血管周圍有淋巴細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞聚集、滲出,包繞血管形成血管套;心肌間質(zhì)疏松,心肌細(xì)胞腫脹,胞質(zhì)疏松淡染,部分心肌潤(rùn)盤(pán)及橫紋結(jié)構(gòu)模糊;胃黏膜局部可見(jiàn)腺體破壞或減少;生精上皮脫落分離、變薄,生精細(xì)胞排列紊亂。結(jié)論:1.磷化鋁片劑暴露在空氣中不穩(wěn)定,易與空氣中水分接觸釋放出磷化氫氣體,造成片劑成分比例改變及周圍環(huán)境氣體污染。本實(shí)驗(yàn)采用將磷化鋁片劑經(jīng)密封袋中碾磨成粉劑后,再稱取一定量的粉劑溶入食用油中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行灌胃,該方法能夠有效減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中磷化鋁在空氣中暴露的時(shí)間,達(dá)到控制實(shí)驗(yàn)變量及增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室安全的效果,可為磷化氫中毒檢測(cè)動(dòng)物模型制備提供參考。2.鉬藍(lán)比色法達(dá)到了生物檢材中毒物檢測(cè)的要求,具有操作簡(jiǎn)便、快速、定性定量較準(zhǔn)確的特點(diǎn),同時(shí)相比于Ag-DDC吡啶法中吡啶惡臭味、吸入過(guò)多對(duì)人體健康產(chǎn)生危害,鉬藍(lán)比色法更加安全環(huán)保,檢測(cè)限有所提高。適用于磷化氫含量較高定性定量檢測(cè),滿足教學(xué)實(shí)驗(yàn)需求,為豐富法醫(yī)學(xué)磷化氫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)提供參考。3.本次實(shí)驗(yàn)采用食用油包裹磷化鋁粉劑灌胃的方法成功建立了急性大鼠磷化鋁灌胃染毒組織病理學(xué)觀察動(dòng)物模型,動(dòng)物染毒后組織病理學(xué)改變觀察清晰明顯,具有針對(duì)性強(qiáng)、安全便捷、可行性高等特點(diǎn),可為未來(lái)口服磷化鋁中毒的相關(guān)研究奠定動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。食用油對(duì)于口服磷化鋁中毒早期催吐治療可能會(huì)具有一定的療效,起到隔離胃酸,減緩磷化鋁遇胃酸釋放磷化氫時(shí)間的作用。4.急性大鼠磷化鋁灌胃染毒大鼠可引起肺、肝、腦、心臟、胃腸、睪丸多器官組織病理學(xué)改變,尤其是對(duì)肺部損傷改變明顯,以肺出血、肺泡壁增厚(毛細(xì)血管充血、間質(zhì)上皮細(xì)胞增生)、局部肺泡壁斷裂及融合為主要病理變化,并表現(xiàn)出中高劑量染毒組以肺充血、肺泡壁稍增厚、局部肺泡壁斷裂及融合為主要肺部表現(xiàn),低劑量染毒組以肺出血、肺泡壁增厚為主要肺部表現(xiàn),染毒死亡各組大鼠肺充血、出血,肺泡壁增厚現(xiàn)象與染毒劑量之間呈負(fù)相關(guān),即染毒死亡組存活時(shí)間越長(zhǎng)肺部病理改變現(xiàn)象越明顯。5.本實(shí)驗(yàn)關(guān)于肺泡壁增厚現(xiàn)象(間質(zhì)上皮細(xì)胞增生)在一定程度上揭示了磷化氫中毒的部分機(jī)制,肺的間質(zhì)上皮細(xì)胞增生是肺部中毒性損傷適應(yīng)性、普遍性、非特異性的組織修復(fù)反應(yīng),是一種氧化應(yīng)激性作用下的肺對(duì)于中毒損害的防御,染毒后存活大鼠遺留有肺泡壁增厚不可逆性損傷,而肺充血、出血現(xiàn)象消失。證明了磷化氫能夠通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制發(fā)揮毒性損害,產(chǎn)生肺部不可逆性間質(zhì)上皮細(xì)胞增生損傷現(xiàn)象。
【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：D919

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