發(fā)布時間：2020-07-03 21:52

【摘要】：背景:在臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,對彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)的診療與鑒定都是核心工作及研究熱點(diǎn)。對于DAI發(fā)生后存活時間較短的案例,更需要能夠及早發(fā)現(xiàn)病因、客觀表征病變、準(zhǔn)確剖析病理。本研究旨在探尋利用傅里葉變換紅外光譜逐點(diǎn)掃描面成像技術(shù)(Fourier transform infrared spectroscopy mapping,FTIR-mapping)檢測DAI的特異性光譜指標(biāo),從化學(xué)鍵的紅外光譜角度探討DAI的病理改變,并嘗試建立一種更為直觀、準(zhǔn)確、靈敏的DAI法醫(yī)病理學(xué)檢測方法。在當(dāng)前的實際工作中,尤其在法醫(yī)學(xué)鑒定上,研究人員對DAI的認(rèn)定主要通過觀察大體標(biāo)本、組織切片,對損傷病變從宏觀到微觀進(jìn)行綜合判斷。由于DAI的病理改變在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)得往往較為復(fù)雜,這對全面認(rèn)識病變,準(zhǔn)確判斷損傷部位與程度提出了較高的技術(shù)要求。一方面是制作組織切片與組織染色要求高。要觀察DAI后軸索的形態(tài)學(xué)改變,或檢測DAI引起的一些生物學(xué)標(biāo)志物的表達(dá)改變,主要利用免疫組織化學(xué)染色、銀染等在亞細(xì)胞水平進(jìn)行的檢測方法。這些方法的高準(zhǔn)確度一定程度上依賴檢材的科學(xué)取樣、切片的標(biāo)準(zhǔn)制作及染色過程的精細(xì)操作,這需要經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員來完成。另一方面是鏡下圖像分析水平要求高。在顯微鏡下分析切片的染色情況,判斷染色陽性強(qiáng)度,是一種較為主觀的組織病理學(xué)查驗過程。若經(jīng)驗不足就常常難以準(zhǔn)確地辨識和認(rèn)定輕度改變或微小病變。另外,傳統(tǒng)方法在用于診斷DAI時自身存在不足之處。譬如,各種生物標(biāo)志物經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后,可能顯示出軸索斷裂,但不能表明系原發(fā)性還是繼發(fā)性,而且倘若軸索尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)改變,標(biāo)志物則不能呈陽性表達(dá)表現(xiàn),無法發(fā)揮出診斷價值。每次免疫組織化學(xué)染色只能對單一某項生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行分析,不能同時聯(lián)用標(biāo)志物體系加以診斷。銀染法對急性期DAI的軸索損傷也不能及時反映。因此,本研究計劃通過動物實驗,利用FTIR-mapping技術(shù),打破依賴軸索形態(tài)診斷DAI的局限性,探索一種能快速、準(zhǔn)確地從分子層面檢測DAI的方法,服務(wù)法醫(yī)病理學(xué)司法鑒定工作。神經(jīng)細(xì)胞具有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu),其化學(xué)組分的物理性質(zhì)在不同部位展現(xiàn)出不同特點(diǎn)。許多疾病、損傷的發(fā)生發(fā)展,會引起組織成分發(fā)生不同變化,并可以表現(xiàn)出紅外光譜的差異。紅外光譜與其它分子光譜類似,能輔助確定分子組成、空間結(jié)構(gòu)。FTIR是將干涉圖經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換所形成的紅外光譜,既可以用于定性分析,又可以用于定量分析,還可以對未知物質(zhì)進(jìn)行解讀。紅外吸收峰的位置、形狀及強(qiáng)度,都透露了未知分子的功能基團(tuán)構(gòu)成,甚至組成的化學(xué)結(jié)構(gòu)。FTIR技術(shù)在樣品制備、檢測操作、數(shù)據(jù)分析、經(jīng)濟(jì)效益等方面都具有顯著優(yōu)勢,檢測限低、適用范圍廣,在化工、醫(yī)藥、珠寶鑒定、法庭科學(xué)等諸多領(lǐng)域都有所應(yīng)用。利用FTIR技術(shù)檢測DAI分子變化,目前報道極少,而利用面成像(mapping)技術(shù)對DAI的分子特征進(jìn)行測定,目前只有楊天潼博士報道過蛋白酰胺Ⅱ帶的檢測成果。用FTIR-mapping技術(shù)探索DAI的分子特征,不僅可以了解分子振動模式、基本基團(tuán)組成,還可以繪制2D、3D化學(xué)圖像,通過紅、黃、綠等色彩差異表現(xiàn)蛋白質(zhì)、核酸等分子基團(tuán)的含量與分布,與特殊染色的病理組織切片相對應(yīng)。本研究屬于化學(xué)技術(shù)與法醫(yī)病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)的交叉性創(chuàng)新研究。目的:建立大鼠DAI模型,觀察大鼠傷后神經(jīng)行為反應(yīng),研究DAI大鼠腦組織β-APP特殊染色、GFAP特殊染色的特征;研究大鼠腦損傷后DAI病變發(fā)生發(fā)展過程,通過FTIR顯微鏡檢測DAI大鼠腦白質(zhì)化學(xué)物質(zhì)成分,尋找特異性紅外光譜指標(biāo);研討mapping圖像與組織病理之間的對應(yīng)關(guān)系,提煉有價值的數(shù)據(jù)結(jié)果,為將來應(yīng)用FTIR-mapping技術(shù)在分子層面上鑒定DAI打下基礎(chǔ)。方法:實驗材料及儀器SD大鼠;落體打擊裝置;傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet TM 7500-Ⅱ)及顯微鏡附件;紅外光譜工作站(OMNIC 6.0);虛擬顯微成像系統(tǒng)(Dotslide 2.1);脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、展片機(jī)、烤片機(jī)等;蘇木素、伊紅、天然樹膠、二甲苯、乙醇、氨水、硝酸銀等。研究方法及實驗手段實驗第一部分:建立軸索損傷模型。選取雌雄不限的SD大鼠共24只,按隨機(jī)抽樣原則分為2組,每組12只,建立Marmarou打擊負(fù)荷損傷模型,落體打擊后24h處死大鼠取腦。對照組只采取手術(shù),不進(jìn)行打擊,直接處死取腦。實驗第二部分:對各組別腦組織進(jìn)行紅外光譜、生物學(xué)標(biāo)志物檢測,并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(1)對樣本腦組織切片進(jìn)行FTIR紅外光譜逐點(diǎn)掃描,繪制mapping圖像:(2)將連續(xù)切片的腦片進(jìn)行β-APP染色,從組織病理學(xué)上確認(rèn)軸索損傷區(qū)域,提取損傷區(qū)域內(nèi)光譜信息,進(jìn)行定量、定性數(shù)據(jù)分析,篩選出DAI特異性紅外光譜參數(shù)。結(jié)果:經(jīng)FTIR-mapping檢測,實驗組的蛋白質(zhì)仲胺N-H伸縮振動、膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的高吸收區(qū)與β-APP驗證的DAI區(qū)相符合,與低吸收區(qū)域相比,高吸收區(qū)吸收度差異性極其顯著(P0.05),二者光譜高低吸收區(qū)的吸收度比率分別較對照組明顯增高;蛋白質(zhì)中CH_3對稱收縮、核酸和磷酸脂質(zhì)PO_2對稱伸縮振動的吸收度與驗證組差異性不顯著(P0.05)。FTIR-mapping的逐點(diǎn)掃描面成像技術(shù)繪制的化學(xué)圖像基本可以反映DAI各大分子分布特征,并且與β-APP驗證的彌漫性軸索損傷區(qū)基本一致。結(jié)論:傅里葉變換紅外(FTIR)顯微光譜是從組織切片中獲取化學(xué)信息的強(qiáng)大技術(shù)。紅外光譜化學(xué)圖像以色彩差的方式揭示基團(tuán)分布情況,并與組織病理相對應(yīng)一致。應(yīng)用FTIR-mapping技術(shù)能直觀表現(xiàn)DAI的分子特征,分析分子指標(biāo)的變化,從分子振動模式、振動頻率推測DAI的發(fā)展過程,從病理形態(tài)學(xué)角度診斷DAI病變的部位,并根據(jù)紅外吸收度值的改變情況判斷腦組織DAI的損傷程度。蛋白質(zhì)仲胺N-H伸縮振動、膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)可以作為診斷DAI的特征性紅外指標(biāo)。經(jīng)過進(jìn)一步深入研究,有望應(yīng)用FTIR-mapping技術(shù)進(jìn)行DAI病理學(xué)診斷。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：D919
【圖文】：

生物力學(xué)機(jī)制。（1）正向撞擊。在交通事故中，由于緊急剎車或追尾車輛，駕駛?cè)祟^部撞向前風(fēng)擋玻璃或乘客頭部撞向前排座椅都屬于此種類型。當(dāng)頭部迎面撞擊前方物體時，雙側(cè)大腦半球因慣性作用繼續(xù)向前移動，雙側(cè)方牽拉可使胼胝體發(fā)生撕裂性軸索損傷。若一側(cè)半球比另一側(cè)位移較快，則胼胝體易發(fā)生偏心性出血，損傷常累及穹隆、扣帶回、透明隔、尾狀核頭部和丘腦背側(cè)等近中線組織結(jié)構(gòu)。（2）暴力扭轉(zhuǎn)。擒拿術(shù)中扭頸動作，做滾團(tuán)動作時頭部位置不正等情形，均可能導(dǎo)致 DAI。暴力扭轉(zhuǎn)頭部，大腦、小腦、腦干等各部位相連接處，由于組織密度差異，穩(wěn)定性相對低，在外力拉伸過程中，位于交界區(qū)的小腦上腳背側(cè)、導(dǎo)水管下端等最容易受到損害，同時其間穿插的神經(jīng)纖維束也會發(fā)生軸索損傷。成角加速傷常常導(dǎo)致腦深部 DAI，表現(xiàn)為彌漫性腦白質(zhì)變性，而無顱內(nèi)血腫等局灶性病變。在不同剪切力下，肉眼或 CT 檢查可見灰質(zhì)白質(zhì)交匯區(qū)、基底節(jié)區(qū)軸索損傷，并可伴有毛細(xì)血管的撕裂、出血。

頭部瞬時加速或減速時產(chǎn)生腦內(nèi)創(chuàng)傷性剪切力，可以牽其通透性及運(yùn)輸物質(zhì)的功能，出現(xiàn)軸索轉(zhuǎn)運(yùn)障礙（impaired axonal DAI 逐步進(jìn)展。這種剪切力可能發(fā)生在道路交通事故、跌倒及暴力]，也可能是由于虐待兒童的結(jié)果[6]，如搖嬰綜合征等。從損傷發(fā)生機(jī)制看，DAI 軸索斷裂可為原發(fā)性，也可為繼發(fā)性[7、8]，可以觀察到軸突的完全離斷，但 DAI 的主要損害是在時間延續(xù)過性軸突斷裂[9]。雖然涉及繼發(fā)性腦損傷的詳細(xì)病理生理機(jī)制仍不清楚傷過程中拉伸軸突會引起細(xì)胞骨架的物理破壞和蛋白質(zhì)水解降解。當(dāng)軸索遭受外力損害時，軸膜通透性明顯增高，在軸突中開放鈉離門控鈣通道打開，Ca2 +流入細(xì)胞[2]。Ca2+存于細(xì)胞將啟動幾種不同關(guān)蛋白酶或蛋白激酶去磷酸化[10]，破壞線粒體和細(xì)胞骨架，使得神軸漿運(yùn)輸密切相關(guān)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排或水解[11、12]，激活第二信使離和細(xì)胞死亡[13]。這種繼發(fā)性損傷為非離斷性軸索損傷。

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本文編號：2740222