【摘要】：背景:在臨床醫(yī)學、法醫(yī)學等領(lǐng)域,對彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)的診療與鑒定都是核心工作及研究熱點。對于DAI發(fā)生后存活時間較短的案例,更需要能夠及早發(fā)現(xiàn)病因、客觀表征病變、準確剖析病理。本研究旨在探尋利用傅里葉變換紅外光譜逐點掃描面成像技術(shù)(Fourier transform infrared spectroscopy mapping,FTIR-mapping)檢測DAI的特異性光譜指標,從化學鍵的紅外光譜角度探討DAI的病理改變,并嘗試建立一種更為直觀、準確、靈敏的DAI法醫(yī)病理學檢測方法。在當前的實際工作中,尤其在法醫(yī)學鑒定上,研究人員對DAI的認定主要通過觀察大體標本、組織切片,對損傷病變從宏觀到微觀進行綜合判斷。由于DAI的病理改變在形態(tài)學上呈現(xiàn)得往往較為復雜,這對全面認識病變,準確判斷損傷部位與程度提出了較高的技術(shù)要求。一方面是制作組織切片與組織染色要求高。要觀察DAI后軸索的形態(tài)學改變,或檢測DAI引起的一些生物學標志物的表達改變,主要利用免疫組織化學染色、銀染等在亞細胞水平進行的檢測方法。這些方法的高準確度一定程度上依賴檢材的科學取樣、切片的標準制作及染色過程的精細操作,這需要經(jīng)驗豐富的技術(shù)人員來完成。另一方面是鏡下圖像分析水平要求高。在顯微鏡下分析切片的染色情況,判斷染色陽性強度,是一種較為主觀的組織病理學查驗過程。若經(jīng)驗不足就常常難以準確地辨識和認定輕度改變或微小病變。另外,傳統(tǒng)方法在用于診斷DAI時自身存在不足之處。譬如,各種生物標志物經(jīng)免疫組織化學染色后,可能顯示出軸索斷裂,但不能表明系原發(fā)性還是繼發(fā)性,而且倘若軸索尚未出現(xiàn)明顯形態(tài)改變,標志物則不能呈陽性表達表現(xiàn),無法發(fā)揮出診斷價值。每次免疫組織化學染色只能對單一某項生物學標志物進行分析,不能同時聯(lián)用標志物體系加以診斷。銀染法對急性期DAI的軸索損傷也不能及時反映。因此,本研究計劃通過動物實驗,利用FTIR-mapping技術(shù),打破依賴軸索形態(tài)診斷DAI的局限性,探索一種能快速、準確地從分子層面檢測DAI的方法,服務(wù)法醫(yī)病理學司法鑒定工作。神經(jīng)細胞具有細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核等結(jié)構(gòu),其化學組分的物理性質(zhì)在不同部位展現(xiàn)出不同特點。許多疾病、損傷的發(fā)生發(fā)展,會引起組織成分發(fā)生不同變化,并可以表現(xiàn)出紅外光譜的差異。紅外光譜與其它分子光譜類似,能輔助確定分子組成、空間結(jié)構(gòu)。FTIR是將干涉圖經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換所形成的紅外光譜,既可以用于定性分析,又可以用于定量分析,還可以對未知物質(zhì)進行解讀。紅外吸收峰的位置、形狀及強度,都透露了未知分子的功能基團構(gòu)成,甚至組成的化學結(jié)構(gòu)。FTIR技術(shù)在樣品制備、檢測操作、數(shù)據(jù)分析、經(jīng)濟效益等方面都具有顯著優(yōu)勢,檢測限低、適用范圍廣,在化工、醫(yī)藥、珠寶鑒定、法庭科學等諸多領(lǐng)域都有所應用。利用FTIR技術(shù)檢測DAI分子變化,目前報道極少,而利用面成像(mapping)技術(shù)對DAI的分子特征進行測定,目前只有楊天潼博士報道過蛋白酰胺Ⅱ帶的檢測成果。用FTIR-mapping技術(shù)探索DAI的分子特征,不僅可以了解分子振動模式、基本基團組成,還可以繪制2D、3D化學圖像,通過紅、黃、綠等色彩差異表現(xiàn)蛋白質(zhì)、核酸等分子基團的含量與分布,與特殊染色的病理組織切片相對應。本研究屬于化學技術(shù)與法醫(yī)病理學、神經(jīng)科學的交叉性創(chuàng)新研究。目的:建立大鼠DAI模型,觀察大鼠傷后神經(jīng)行為反應,研究DAI大鼠腦組織β-APP特殊染色、GFAP特殊染色的特征;研究大鼠腦損傷后DAI病變發(fā)生發(fā)展過程,通過FTIR顯微鏡檢測DAI大鼠腦白質(zhì)化學物質(zhì)成分,尋找特異性紅外光譜指標;研討mapping圖像與組織病理之間的對應關(guān)系,提煉有價值的數(shù)據(jù)結(jié)果,為將來應用FTIR-mapping技術(shù)在分子層面上鑒定DAI打下基礎(chǔ)。方法:實驗材料及儀器SD大鼠;落體打擊裝置;傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet TM 7500-Ⅱ)及顯微鏡附件;紅外光譜工作站(OMNIC 6.0);虛擬顯微成像系統(tǒng)(Dotslide 2.1);脫水機、包埋機、切片機、展片機、烤片機等;蘇木素、伊紅、天然樹膠、二甲苯、乙醇、氨水、硝酸銀等。研究方法及實驗手段實驗第一部分:建立軸索損傷模型。選取雌雄不限的SD大鼠共24只,按隨機抽樣原則分為2組,每組12只,建立Marmarou打擊負荷損傷模型,落體打擊后24h處死大鼠取腦。對照組只采取手術(shù),不進行打擊,直接處死取腦。實驗第二部分:對各組別腦組織進行紅外光譜、生物學標志物檢測,并進行數(shù)據(jù)分析。(1)對樣本腦組織切片進行FTIR紅外光譜逐點掃描,繪制mapping圖像:(2)將連續(xù)切片的腦片進行β-APP染色,從組織病理學上確認軸索損傷區(qū)域,提取損傷區(qū)域內(nèi)光譜信息,進行定量、定性數(shù)據(jù)分析,篩選出DAI特異性紅外光譜參數(shù)。結(jié)果:經(jīng)FTIR-mapping檢測,實驗組的蛋白質(zhì)仲胺N-H伸縮振動、膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的高吸收區(qū)與β-APP驗證的DAI區(qū)相符合,與低吸收區(qū)域相比,高吸收區(qū)吸收度差異性極其顯著(P0.05),二者光譜高低吸收區(qū)的吸收度比率分別較對照組明顯增高;蛋白質(zhì)中CH_3對稱收縮、核酸和磷酸脂質(zhì)PO_2對稱伸縮振動的吸收度與驗證組差異性不顯著(P0.05)。FTIR-mapping的逐點掃描面成像技術(shù)繪制的化學圖像基本可以反映DAI各大分子分布特征,并且與β-APP驗證的彌漫性軸索損傷區(qū)基本一致。結(jié)論:傅里葉變換紅外(FTIR)顯微光譜是從組織切片中獲取化學信息的強大技術(shù)。紅外光譜化學圖像以色彩差的方式揭示基團分布情況,并與組織病理相對應一致。應用FTIR-mapping技術(shù)能直觀表現(xiàn)DAI的分子特征,分析分子指標的變化,從分子振動模式、振動頻率推測DAI的發(fā)展過程,從病理形態(tài)學角度診斷DAI病變的部位,并根據(jù)紅外吸收度值的改變情況判斷腦組織DAI的損傷程度。蛋白質(zhì)仲胺N-H伸縮振動、膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)可以作為診斷DAI的特征性紅外指標。經(jīng)過進一步深入研究,有望應用FTIR-mapping技術(shù)進行DAI病理學診斷。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：D919
【圖文】：

生物力學機制。（1）正向撞擊。在交通事故中，由于緊急剎車或追尾車輛，駕駛?cè)祟^部撞向前風擋玻璃或乘客頭部撞向前排座椅都屬于此種類型。當頭部迎面撞擊前方物體時，雙側(cè)大腦半球因慣性作用繼續(xù)向前移動，雙側(cè)方牽拉可使胼胝體發(fā)生撕裂性軸索損傷。若一側(cè)半球比另一側(cè)位移較快，則胼胝體易發(fā)生偏心性出血，損傷常累及穹隆、扣帶回、透明隔、尾狀核頭部和丘腦背側(cè)等近中線組織結(jié)構(gòu)。（2）暴力扭轉(zhuǎn)。擒拿術(shù)中扭頸動作，做滾團動作時頭部位置不正等情形，均可能導致 DAI。暴力扭轉(zhuǎn)頭部，大腦、小腦、腦干等各部位相連接處，由于組織密度差異，穩(wěn)定性相對低，在外力拉伸過程中，位于交界區(qū)的小腦上腳背側(cè)、導水管下端等最容易受到損害，同時其間穿插的神經(jīng)纖維束也會發(fā)生軸索損傷。成角加速傷常常導致腦深部 DAI，表現(xiàn)為彌漫性腦白質(zhì)變性，而無顱內(nèi)血腫等局灶性病變。在不同剪切力下，肉眼或 CT 檢查可見灰質(zhì)白質(zhì)交匯區(qū)、基底節(jié)區(qū)軸索損傷，并可伴有毛細血管的撕裂、出血。

頭部瞬時加速或減速時產(chǎn)生腦內(nèi)創(chuàng)傷性剪切力，可以牽其通透性及運輸物質(zhì)的功能，出現(xiàn)軸索轉(zhuǎn)運障礙（impaired axonal DAI 逐步進展。這種剪切力可能發(fā)生在道路交通事故、跌倒及暴力]，也可能是由于虐待兒童的結(jié)果[6]，如搖嬰綜合征等。從損傷發(fā)生機制看，DAI 軸索斷裂可為原發(fā)性，也可為繼發(fā)性[7、8]，可以觀察到軸突的完全離斷，但 DAI 的主要損害是在時間延續(xù)過性軸突斷裂[9]。雖然涉及繼發(fā)性腦損傷的詳細病理生理機制仍不清楚傷過程中拉伸軸突會引起細胞骨架的物理破壞和蛋白質(zhì)水解降解。當軸索遭受外力損害時，軸膜通透性明顯增高，在軸突中開放鈉離門控鈣通道打開，Ca2 +流入細胞[2]。Ca2+存于細胞將啟動幾種不同關(guān)蛋白酶或蛋白激酶去磷酸化[10]，破壞線粒體和細胞骨架，使得神軸漿運輸密切相關(guān)的細胞骨架結(jié)構(gòu)重排或水解[11、12]，激活第二信使離和細胞死亡[13]。這種繼發(fā)性損傷為非離斷性軸索損傷。

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本文編號：2740222