【摘要】：研究目的:巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷修復(fù)中起重要作用,但其作用機(jī)制尚不清楚。因而,我們構(gòu)建骨骼肌鈍挫傷模型,觀察骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)規(guī)律及肌纖維形態(tài)、再生肌纖維大小、膠原沉積情況,以闡明巨噬細(xì)胞在骨骼肌挫傷修復(fù)過程中的作用及作用機(jī)制。研究方法:將40只雄性C57BL/6小鼠(平均體重為21.3g,購買于上海杰思捷實驗動物有限公司)隨機(jī)分為兩組:正常對照組(C,n=8),骨骼肌鈍挫傷組(S,n=8),根據(jù)取材時間點(diǎn)的不同,鈍挫傷組又可分為傷后3d,6d,12d和24d(每個時間點(diǎn)均為8只)。骨骼肌挫傷后3d,6d,12d,24d取雙側(cè)腓腸肌。HE染色觀察骨骼肌再生肌纖維形態(tài),Masson三色染色觀察挫傷骨骼肌膠原沉積情況以及熒光定量PCR測定促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶基因表達(dá)變化。研究結(jié)果:1.骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中再生肌纖維形態(tài)及細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)變化HE染色結(jié)果顯示,骨骼肌鈍挫傷后肌纖維結(jié)構(gòu)破壞,大量肌纖維腫脹,壞死(傷后第3d),損傷后第6d和第12d出現(xiàn)大量再生肌纖維,中央成核肌纖維數(shù)量增加,傷后第24d,中央成核肌纖維數(shù)量減少,細(xì)胞核開始從中央向邊緣移動。MyoD和myogenin是肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化的標(biāo)記物,熒光定量PCR結(jié)果顯示,骨骼肌鈍挫傷后第3d和第6d MyoD和myogenin mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(p0.01),傷后第3d達(dá)到峰值,傷后3d至24d其表達(dá)呈下降趨勢,24d時基本恢復(fù)到對照組水平。2.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中纖維化情況masson三色染色結(jié)果顯示,與正常對照組相比,傷后第12d,大量的藍(lán)色膠原纖維包圍在新生肌纖維周圍,傷后第24d,藍(lán)色纖維化區(qū)域有所減少,但與12d相比,并沒有顯著下降(p0.05)。PCR結(jié)果顯示,促纖維化因子TGF-β1 mRNA在鈍挫傷后3d、6d、12d表達(dá)均顯著高于對照組水平(p0.01),傷后第3d達(dá)到峰值,傷后第3d至傷后24d呈下降趨勢。而TGF-β家族的另一個成員myostatin在鈍挫傷骨骼肌修復(fù)過程中的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。3.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況熒光定量PCR結(jié)果表明,傷后第3d至傷后第6d,M1巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68、M2巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD163和CD206 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組(p0.01),CD68 mRNA表達(dá)量在傷后第3d達(dá)到峰值,傷后第3d到24d其表達(dá)量呈下降趨勢;而CD163和CD206 mRNA表達(dá)量在傷后第6d達(dá)到峰值,傷后第6d到傷后第24d其表達(dá)呈下降趨勢,傷后24d基本恢復(fù)到對照組水平。4.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中肌再生因子表達(dá)情況對骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中肌再生因子進(jìn)行PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),IGF-1和MGF mRNA在傷后第6d達(dá)到峰值(p0.01),隨后其表達(dá)呈下降趨勢,但其在傷后第12d表達(dá)量仍顯著高于正常對照組(p0.05)。HGF、uPA、COX-2也是重要的肌再生因子,與對照組相比,它們在傷后第3d和第6d的表達(dá)均顯著增加(p0.01),且在第3d達(dá)到峰值,傷后第3d到24d,它們的表達(dá)水平呈下降趨勢,24d時基本恢復(fù)到對照組水平。5.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中炎癥因子表達(dá)情況熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,骨骼肌挫傷組炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、TWEAK、fn14、IL-10)在損傷后3d、6d顯著升高(p0.01),IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、fn14 mRNA表達(dá)水平在傷后第3d達(dá)到峰值,傷后第3d至傷后第24d其表達(dá)呈下降趨勢,TWEAK、IL-10基因表達(dá)在傷后第6d達(dá)到峰值,隨后下降,24 d時基本恢復(fù)到正常水平。6.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中趨化因子表達(dá)情況熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,鈍挫傷骨骼肌中趨化因子(CCL2、CCR2、CXCR4)在損傷后第3d表達(dá)顯著上調(diào)(p0.01),且達(dá)到峰值,CCL5 mRNA表達(dá)水平在挫傷后第6d達(dá)到峰值,傷后第6d至傷后第12d呈下降趨勢,24d時基本恢復(fù)到對照組水平。7.骨骼肌鈍挫傷再生修復(fù)過程中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)情況熒光定量PCR結(jié)果表明,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-10 mRNA表達(dá)量在損傷后第6d達(dá)到峰值(p0.01),傷后第6d至12d其表達(dá)呈下降趨勢,但MMP-2和MMP-10 mRNA在傷后第3d和第12d的表達(dá)量仍顯著高于對照組。8.巨噬細(xì)胞特異標(biāo)記物與促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶之間的聯(lián)系皮爾遜相關(guān)分析結(jié)果表明,M1巨噬細(xì)胞(CD68)與肌再生因子(HGF、uPA、COX-2)、炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ、IL-10、TWEAK)、促纖維化因子(TGF-β1)、趨化因子(CCL2、CCR2)具有顯著相關(guān)性,M2巨噬細(xì)胞(CD163)與炎癥因子(IL-10、fn14)、肌再生因子(COX-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-10)相關(guān),M2巨噬細(xì)胞(CD206)與肌再生因子(IGF-1、MGF、COX-2)、趨化因子(CCL5)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-2)具有顯著相關(guān)性。結(jié)論1.骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中,促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)均出現(xiàn)顯著變化,這表明它們可能在骨骼肌鈍挫傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。2.巨噬細(xì)胞在骨骼肌再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)或分泌促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質(zhì)金屬蛋白酶參與損傷骨骼肌修復(fù)。
【學(xué)位授予單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R873
【圖文】：

骨骼肌挫傷修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的作用及機(jī)制研究3.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗結(jié)果采用 SPSS 22.0 軟件處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，并對組間均數(shù)的差異進(jìn)行比較。p<0.05 表示顯著性差異，p<0.01 表示非常顯著性差異。4.實驗結(jié)果4.1 骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中再生肌纖維大小及細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)變化

發(fā)揮其吞噬功能并分泌細(xì)胞因子，部分區(qū)域嗜酸性增強(qiáng)，胞質(zhì)顏色加深；傷后第6d，炎性細(xì)胞浸潤減少，損傷組織被吞噬，肌衛(wèi)星細(xì)胞受生長因子及損傷肌肉釋放信號的刺激而活化，遷移到損傷部位進(jìn)行增殖、延伸，形成單核或多核肌管細(xì)胞[3]，但再生肌纖維數(shù)量仍較少，直徑較��；傷后第 12d，再生肌纖維體積進(jìn)一步增加，中央成核肌纖維數(shù)量增加，部分再生肌細(xì)胞成熟；傷后第 24d，細(xì)胞排列緊密，邊界清晰，多核肌管細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，細(xì)胞核偏離細(xì)胞中央向邊緣移動，新生肌纖維成熟，標(biāo)志著鈍挫傷骨骼肌修復(fù)基本完成。另外，我們借助熒光定量 PCR 技術(shù)對骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中的肌纖維再生標(biāo)記物進(jìn)行檢測，與正常對照組相比，MyoD mRNA（肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖標(biāo)記物）表達(dá)水平在傷后第 3d、第 6d 顯著增加（p<0.01），傷后第 3d 達(dá)到峰值，傷后第3d 至 24d，其表達(dá)呈下降趨勢，鈍挫傷后第 24d 時基本恢復(fù)到對照組水平，肌衛(wèi)星細(xì)胞可分化為成肌細(xì)胞參與損傷修復(fù)，myogenin mRNA 表達(dá)情況可反映肌衛(wèi)星細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn) myogenin mRNA 在挫傷后第 3d 的表達(dá)量顯著高于對照組（p<0.01），傷后 3d 至 24d 呈下降趨勢，但其在第 6d 的表達(dá)仍高于正常對照組（p<0.05）。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2722025