【摘要】：研究目的:巨噬細胞在骨骼肌損傷修復中起重要作用,但其作用機制尚不清楚。因而,我們構建骨骼肌鈍挫傷模型,觀察骨骼肌鈍挫傷修復過程中促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶的表達規(guī)律及肌纖維形態(tài)、再生肌纖維大小、膠原沉積情況,以闡明巨噬細胞在骨骼肌挫傷修復過程中的作用及作用機制。研究方法:將40只雄性C57BL/6小鼠(平均體重為21.3g,購買于上海杰思捷實驗動物有限公司)隨機分為兩組:正常對照組(C,n=8),骨骼肌鈍挫傷組(S,n=8),根據(jù)取材時間點的不同,鈍挫傷組又可分為傷后3d,6d,12d和24d(每個時間點均為8只)。骨骼肌挫傷后3d,6d,12d,24d取雙側腓腸肌。HE染色觀察骨骼肌再生肌纖維形態(tài),Masson三色染色觀察挫傷骨骼肌膠原沉積情況以及熒光定量PCR測定促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶基因表達變化。研究結果:1.骨骼肌鈍挫傷修復過程中再生肌纖維形態(tài)及細胞標記物表達變化HE染色結果顯示,骨骼肌鈍挫傷后肌纖維結構破壞,大量肌纖維腫脹,壞死(傷后第3d),損傷后第6d和第12d出現(xiàn)大量再生肌纖維,中央成核肌纖維數(shù)量增加,傷后第24d,中央成核肌纖維數(shù)量減少,細胞核開始從中央向邊緣移動。MyoD和myogenin是肌衛(wèi)星細胞增殖、分化的標記物,熒光定量PCR結果顯示,骨骼肌鈍挫傷后第3d和第6d MyoD和myogenin mRNA表達水平顯著高于對照組(p0.01),傷后第3d達到峰值,傷后3d至24d其表達呈下降趨勢,24d時基本恢復到對照組水平。2.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中纖維化情況masson三色染色結果顯示,與正常對照組相比,傷后第12d,大量的藍色膠原纖維包圍在新生肌纖維周圍,傷后第24d,藍色纖維化區(qū)域有所減少,但與12d相比,并沒有顯著下降(p0.05)。PCR結果顯示,促纖維化因子TGF-β1 mRNA在鈍挫傷后3d、6d、12d表達均顯著高于對照組水平(p0.01),傷后第3d達到峰值,傷后第3d至傷后24d呈下降趨勢。而TGF-β家族的另一個成員myostatin在鈍挫傷骨骼肌修復過程中的表達水平?jīng)]有顯著性差異。3.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中巨噬細胞標記物表達情況熒光定量PCR結果表明,傷后第3d至傷后第6d,M1巨噬細胞標記物CD68、M2巨噬細胞標記物CD163和CD206 mRNA表達水平均顯著高于對照組(p0.01),CD68 mRNA表達量在傷后第3d達到峰值,傷后第3d到24d其表達量呈下降趨勢;而CD163和CD206 mRNA表達量在傷后第6d達到峰值,傷后第6d到傷后第24d其表達呈下降趨勢,傷后24d基本恢復到對照組水平。4.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中肌再生因子表達情況對骨骼肌鈍挫傷修復過程中肌再生因子進行PCR檢測,結果發(fā)現(xiàn),IGF-1和MGF mRNA在傷后第6d達到峰值(p0.01),隨后其表達呈下降趨勢,但其在傷后第12d表達量仍顯著高于正常對照組(p0.05)。HGF、uPA、COX-2也是重要的肌再生因子,與對照組相比,它們在傷后第3d和第6d的表達均顯著增加(p0.01),且在第3d達到峰值,傷后第3d到24d,它們的表達水平呈下降趨勢,24d時基本恢復到對照組水平。5.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中炎癥因子表達情況熒光定量PCR結果顯示,與對照組相比,骨骼肌挫傷組炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、TWEAK、fn14、IL-10)在損傷后3d、6d顯著升高(p0.01),IL-6、IL-1β、TNF-γ、INF-α、fn14 mRNA表達水平在傷后第3d達到峰值,傷后第3d至傷后第24d其表達呈下降趨勢,TWEAK、IL-10基因表達在傷后第6d達到峰值,隨后下降,24 d時基本恢復到正常水平。6.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中趨化因子表達情況熒光定量PCR結果顯示,與對照組相比,鈍挫傷骨骼肌中趨化因子(CCL2、CCR2、CXCR4)在損傷后第3d表達顯著上調(p0.01),且達到峰值,CCL5 mRNA表達水平在挫傷后第6d達到峰值,傷后第6d至傷后第12d呈下降趨勢,24d時基本恢復到對照組水平。7.骨骼肌鈍挫傷再生修復過程中基質金屬蛋白酶表達情況熒光定量PCR結果表明,基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、MMP-10 mRNA表達量在損傷后第6d達到峰值(p0.01),傷后第6d至12d其表達呈下降趨勢,但MMP-2和MMP-10 mRNA在傷后第3d和第12d的表達量仍顯著高于對照組。8.巨噬細胞特異標記物與促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶之間的聯(lián)系皮爾遜相關分析結果表明,M1巨噬細胞(CD68)與肌再生因子(HGF、uPA、COX-2)、炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ、IL-10、TWEAK)、促纖維化因子(TGF-β1)、趨化因子(CCL2、CCR2)具有顯著相關性,M2巨噬細胞(CD163)與炎癥因子(IL-10、fn14)、肌再生因子(COX-2)、基質金屬蛋白酶(MMP-10)相關,M2巨噬細胞(CD206)與肌再生因子(IGF-1、MGF、COX-2)、趨化因子(CCL5)、基質金屬蛋白酶(MMP-9、MMP-2)具有顯著相關性。結論1.骨骼肌鈍挫傷修復過程中,促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶的表達均出現(xiàn)顯著變化,這表明它們可能在骨骼肌鈍挫傷修復中發(fā)揮重要作用。2.巨噬細胞在骨骼肌再生中發(fā)揮關鍵作用,其機制可能是通過調節(jié)或分泌促纖維化因子、肌再生因子、炎癥因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶參與損傷骨骼肌修復。
【學位授予單位】：上海體育學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R873
【圖文】：

骨骼肌挫傷修復過程中巨噬細胞的作用及機制研究3.3 統(tǒng)計學分析實驗結果采用 SPSS 22.0 軟件處理，結果以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析對基因表達數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并對組間均數(shù)的差異進行比較。p<0.05 表示顯著性差異，p<0.01 表示非常顯著性差異。4.實驗結果4.1 骨骼肌鈍挫傷修復過程中再生肌纖維大小及細胞標記物表達變化

發(fā)揮其吞噬功能并分泌細胞因子，部分區(qū)域嗜酸性增強，胞質顏色加深；傷后第6d，炎性細胞浸潤減少，損傷組織被吞噬，肌衛(wèi)星細胞受生長因子及損傷肌肉釋放信號的刺激而活化，遷移到損傷部位進行增殖、延伸，形成單核或多核肌管細胞[3]，但再生肌纖維數(shù)量仍較少，直徑較��；傷后第 12d，再生肌纖維體積進一步增加，中央成核肌纖維數(shù)量增加，部分再生肌細胞成熟；傷后第 24d，細胞排列緊密，邊界清晰，多核肌管細胞數(shù)量進一步增多，細胞核偏離細胞中央向邊緣移動，新生肌纖維成熟，標志著鈍挫傷骨骼肌修復基本完成。另外，我們借助熒光定量 PCR 技術對骨骼肌鈍挫傷修復過程中的肌纖維再生標記物進行檢測，與正常對照組相比，MyoD mRNA（肌衛(wèi)星細胞增殖標記物）表達水平在傷后第 3d、第 6d 顯著增加（p<0.01），傷后第 3d 達到峰值，傷后第3d 至 24d，其表達呈下降趨勢，鈍挫傷后第 24d 時基本恢復到對照組水平，肌衛(wèi)星細胞可分化為成肌細胞參與損傷修復，myogenin mRNA 表達情況可反映肌衛(wèi)星細胞分化。本研究發(fā)現(xiàn) myogenin mRNA 在挫傷后第 3d 的表達量顯著高于對照組（p<0.01），傷后 3d 至 24d 呈下降趨勢，但其在第 6d 的表達仍高于正常對照組（p<0.05）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 肖衛(wèi)華;陳佩杰;劉宇;;巨噬細胞在骨骼肌急性損傷修復中的作用研究進展[J];中國運動醫(yī)學雜志;2014年03期

2 楊建斌,馮紅超,宋宇峰;口腔鱗癌中單核細胞趨化蛋白-1在巨噬細胞浸潤、聚集中的意義[J];中國腫瘤臨床;2005年20期

相關碩士學位論文 前2條

1 劉曉光;巨噬細胞剔除對損傷骨骼肌再生的影響及機制研究[D];上海體育學院;2017年

2 吳志彬;低強度脈沖超聲對老年鼠損傷骨骼肌纖維化的影響及機制[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

本文編號：2722025