【摘要】：背景和目的單核甘酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是人類可遺傳變異中最常見的一種,表現(xiàn)為基因組水平上單個核苷酸變異所引起的DNA序列的多態(tài)性,因其具有擴增片段小、突變率低、檢測方法靈活以及包含表型和祖先信息等優(yōu)點,已經(jīng)引起了法醫(yī)學遺傳學家的廣泛關(guān)注。目前通過毛細管電泳(CE)和新一代測序(NGS)技術(shù),已經(jīng)建立了幾個基于雙等位基因和三等位基因SNP的法醫(yī)個體識別體系。SNP作為一種多態(tài)性遺傳標記,在對血統(tǒng)和表型相關(guān)的特征進行分析時可得到與STR鑒定一致的結(jié)果,特別是在降解檢材中或者微量檢材中相比STR能夠獲取更多的信息,所以我們可以將其應用在STR無法完成的個體識別中。目前,法醫(yī)學相關(guān)的SNP主要是通過SNaPshot技術(shù)進行基因分型,因為其基因分型平臺ABI 3730-XL測序儀,是法醫(yī)物證實驗室中非常普遍的設備。SNP還可以用于對復雜性疾病遺傳因素的研究,通過對比大量病人與普通人群之間在DNA變異方面的頻率差別,以期發(fā)現(xiàn)復雜疾病中遺傳變異所產(chǎn)生的效應。國內(nèi)外對于復雜性疾病的遺傳因素的研究主要集中在對候選基因的單核苷酸多態(tài)性位點的篩選上,即通過對候選基因的分析來研究該位點與疾病的相關(guān)性,從而確定某些位點是疾病相關(guān)的遺傳風險因子。顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm,IA)是由于血管內(nèi)皮層的薄弱導致的顱內(nèi)動脈的局限性擴張和管壁變薄為特征的獲得性腦血管異常疾病,據(jù)統(tǒng)計,顱內(nèi)動脈瘤的一般發(fā)病率為3.2%,蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)的年發(fā)病率為9/1萬,死亡率高達50%,占各種類型的腦血管意外事件的比例為5%左右,而發(fā)生蛛網(wǎng)膜下腔出血的原因約有85%是由于顱內(nèi)動脈瘤破裂。流行病學與遺傳學研究表明,顱內(nèi)動脈瘤由多種遺傳與環(huán)境因素以及它們的相互作用有關(guān),具有群體遺傳異質(zhì)性強、外顯率低、多基因參與等特征,但其遺傳模式尚未確定。對于顱內(nèi)動脈瘤的遺傳學研究的方法主要包括:連鎖分析與候選基因研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究、表達學研究以及全外顯子組測序。雖然通過遺傳學研究已經(jīng)確定了一些與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)的易感基因和位點,但仍有更多的危險因素和致病機制有待發(fā)掘。目前在亞洲人群以及歐洲人群中已經(jīng)進行了多項關(guān)于顱內(nèi)動脈瘤的GWAS研究,并發(fā)現(xiàn)了一些新的潛在的遺傳危險因子,但是,所得結(jié)論在不同群體間不盡相同,因此,用SNP關(guān)聯(lián)分析查找在我國漢族群體中顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)基因很有必要。本研究所選取的24個SNP位點位于已經(jīng)報道的顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)基因或可疑相關(guān)基因區(qū)域,調(diào)查這些位點在河南漢族群體和顱內(nèi)動脈瘤患者群體內(nèi)的遺傳多態(tài)性分布及其差異,查找顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)基因,對探討顱內(nèi)動脈瘤的發(fā)病機制、發(fā)展新的診療方法和風險預測可提供幫助,同時,本研究得到的群體遺傳多態(tài)性信息為這些基因座在法醫(yī)學方面的應用奠定基礎。方法1、收集2015年3月至2017年3月在鄭州大學第一附屬醫(yī)院介入科收治的顱內(nèi)動脈瘤患者192例,所有患者均經(jīng)臨床檢查(病史、體征、生化檢驗、MRA/CTA/DSA)確診。采集192例患者清晨空腹外周血2ml,置于EDTA抗凝管中待用。對照組為在河南省紅十字血液中心收集到的188例獻血人群的。2、使用萊楓公司2ml血液基因組DNA提取試劑盒提取共380份外周血基因組DNA,并用紫外分光光度計測量所提取DNA的濃度和純度。3、通過查閱文獻選擇與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)的候選基因,在候選基因中挑出MAF較高的SNP位點。隨后,利用SNaPshot方法構(gòu)建熒光標記復合分型體系,通過多重PCR反應擴增出包含24個位點的24個長度在100—400bp的片段,對純化后的PCR產(chǎn)物進行SNaPshot多重單堿基延伸反應,最后延伸產(chǎn)物上ABI3730XL測序儀進行基因分型;4、整理所得結(jié)果并進行統(tǒng)計學分析,計算法醫(yī)學相關(guān)參數(shù),分析病例組與對照組之間在DNA變異方面的頻度差別,判斷遺傳變異產(chǎn)生的效應。結(jié)果1、檢測24個SNP位點在河南漢族人群中的基因型頻率分布,χ~2檢驗顯示其分布均符合哈迪溫伯格平衡定律。2、在河南漢族人群中,所選24個SNP位點的累計個體識別率達0.999998,累計非父排除概率為0.968814,累計匹配概率為7.875×10~(-10)。3、rs1072737(χ~2=6.325,Р=0.042)、rs17576(χ~2=6.778,Р=0.034)、rs1800255(χ~2=14.387,Р=0.001)這三個位點的基因型頻率在疾病組與對照組之間的分布差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4、rs2275271(OR=1.343,95%CI=1.007~1.791,Р=0.044),rs1800255(OR=1.756,95%CI=1.225~2.516,Р=0.002),這兩個位點的等位基因頻率在疾病組與對照組之間的分布差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05,OR1,95%CI1)。結(jié)論1、所選24個SNP位點在法醫(yī)學中的個體識別和親子鑒定方面具有應用價值。2、在河南漢族人群中rs17576、rs1800255、rs1072737這三個SNPs位點多態(tài)性分布與顱內(nèi)動脈瘤存在關(guān)聯(lián)。3、在河南漢族人群中rs2275271位點的T等位基因和rs1800255位點的G等位基因可能是顱內(nèi)動脈瘤的遺傳風險因子,可增加患病風險。
【圖文】：

圖 1 單核苷酸多態(tài)性SNP 標記比其它的遺傳標記物更能真實地反映人種、人群及個體異。我們?nèi)祟惖淖嫦缺徽J為誕生在非洲大陸，后來，他們的后代歲月而移居到了世界各地，產(chǎn)生了不同的人種、人群，并形成了，故不同人種之間，，遺傳標記的位點及意義都有所不同。全基因人類基因組單體型圖計劃產(chǎn)生了大量的 SNP 數(shù)據(jù)，基于可被推測類型，可將法醫(yī)學相關(guān)的 SNP 分為四類：用于個體識別的身份信（IISNPs），用于譜系推斷的連鎖信息性遺傳標記（LISNPs），體可能的地域或種族來源的祖先信息性遺傳標記（AISNPs）以及外部可視化特征的表型信息性遺傳標記（PISNPs）[12]。SNP 作為傳標記，在對血統(tǒng)和表型相關(guān)的特征進行分析時可得到與 STR 鑒，有研究認為 25-45 個 SNP 位點就可達到 CODIS 系統(tǒng)的 13 個的隨即匹配概率，且由于其具有擴增片段短、突變率低、分布廣多等特點，法醫(yī)在降解檢材或者微量檢材中能夠獲取更多的信息

圖 2 顱內(nèi)動脈瘤的位置和形狀示意圖前，顱內(nèi)動脈瘤遺傳學因素研究的熱點主要集中在對于顱內(nèi)動脈態(tài)性的研究，關(guān)于顱內(nèi)動脈瘤的遺傳學研究的方法主要包括：連基因研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究、表達學研究以及全外顯子組測序傳學研究已經(jīng)確定了一些與顱內(nèi)動脈瘤相關(guān)的易感基因和位點，危險因素和致病機制有待發(fā)掘。本研究選取了 24 個 SNP 位點的多，其中 18 個位點的選擇方法是首先選擇出 18 個文獻中報道過的易感基因，再通過 NCBI 網(wǎng)站查詢這些基因上所有的 SNP 位點信出最小等位基因頻率（MinimumAllele Frequency，MAF）最高的外 6 個位點的選擇方法是從文獻中選取與顱內(nèi)動脈瘤密切相關(guān)的研究通過分析基因型和等位基因頻率在動脈瘤組與對照組之間的變異產(chǎn)生的效應，對顱內(nèi)動脈瘤的醫(yī)學遺傳學相關(guān)研究方面給予為個體對環(huán)境、疾病反應等差異性基因的數(shù)據(jù)提供參考，并對于其他人種中的易感基因位點在中國漢族人群中進行了重復驗證。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：D919

【參考文獻】

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本文編號：2700981