發(fā)布時間：2020-05-21 17:50

【摘要】：研究背景自19世紀(jì)80年代末90年代初開始,STR分型技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用于法醫(yī)工作的個體識別和親權(quán)鑒定實踐中。作為第二代DNA遺傳標(biāo)記的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)也以其在基因組中分布廣泛、遺傳多態(tài)性信息含量高、檢測高效快速、數(shù)據(jù)分析簡便以及標(biāo)準(zhǔn)化、自動化程度高等特點,被廣泛應(yīng)用在法醫(yī)工作實踐、目的基因檢測及基因診斷、器官移植、動植物育種、基因定位、群體遺傳研究、種群進化等實際應(yīng)用和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。與常染色體STR和Y染色體STR復(fù)合擴增體系在法醫(yī)實踐中的廣泛應(yīng)用相比,X染色體STR相關(guān)復(fù)合擴增體系的建立和商品試劑盒的開發(fā)一直處于緩慢發(fā)展階段。而X染色體STR在復(fù)雜親權(quán)關(guān)系和混合疑難檢材鑒定實踐中有著重要甚至不可替代的作用。目前國際上應(yīng)用最廣泛的是德國QIANGEN公司的ARGUS X12試劑盒。而本文選取的19個X-STR熒光檢測體系(即AGCU X19熒光檢測體系)較之有著更多的連鎖群,更高的分辨率,本研究對該體系進行法醫(yī)學(xué)驗證,并收集國內(nèi)河南漢族、浙江漢族、寧夏回族、新疆維吾爾族、西藏藏族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西仫佬族八個民族人群樣本進行多態(tài)性調(diào)查,為法醫(yī)實踐和群體遺傳研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。目的對 19 個 X-STR 基因座(DXS7423,DXS10148,DXS8378,DXS10162,DXS7132,DXS10079,DXS10103,DXS10101,HPTRB,DXS10074,DXS10135,DXS10159,DXS10164,DXS10075,DXS6809,DXS6789,DXS7424,DXS101,DXS10134)的復(fù)合擴增體系進行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用驗證,并針對國內(nèi)河南漢族、浙江漢族、寧夏回族、新疆維吾爾族、西藏藏族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西仫佬族八個民族人群做群體多態(tài)性調(diào)查,為法醫(yī)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。應(yīng)用X-STR基因座的等位基因分布,對不同地區(qū)的人群進行遺傳距離計算,分析群體遺傳距離,為群體遺傳學(xué)、人類學(xué)、民族學(xué)、考古學(xué)、非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護等領(lǐng)域提供重要的參考價值。方法依據(jù) DNA 分析方法科學(xué)工作組(Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM)驗證指南,對19個X-STR熒光檢測體系進行法醫(yī)學(xué)驗證。采集我國河南漢族、浙江漢族、新疆維吾爾族、西藏藏族、寧夏回族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西仫佬族八個民族共計2157份無關(guān)個體樣本,使用19個X-STR熒光檢測體系進行X染色體STR分型檢測,計算各基因座等位基因分布、進行基因座獨立性檢驗,統(tǒng)計遺傳多態(tài)性、個體識別力、非父排除率等法醫(yī)學(xué)參數(shù),統(tǒng)計分析各人群之間遺傳距離、親緣關(guān)系和人群遷徙進化。結(jié)果體系驗證可知,19個X-STR熒光檢測體系的靈敏度為0.125ng,對0.0625ng模板量的樣本能檢出大部分的等位基因。對非人源DNA有無特異性擴增。對法醫(yī)實踐工作常見的抑制劑(300μmol/L血紅素濃度、10 mmol/L靛藍濃度、50μg/μ1腐殖酸濃度、2.5mmol/L的離子、400 μ mol/L血紅蛋白濃度、1200 mMEDTA濃度)有較好的耐受性。等位基因片段遷移偏差小于0.2bp,低于遺傳分析的0.5bp的分辨容忍度,分型準(zhǔn)確。該檢測體系在不同實驗室不同儀器上對相同樣本分型結(jié)果抑制,可重復(fù)性好。stutter比率低于150%,不影響正常分型,結(jié)果可靠。對大部分的常見日常案件檢材均可得到完整分型。該體系對混合比例為1:1～1:9的混合樣本分型可有效區(qū)分優(yōu)劣勢供體。體系PCR反應(yīng)組分在0.75×～1.25×之間時,仍能得到完整分型,當(dāng)一種組分降到0.5×?xí)r,會出現(xiàn)等位基因丟失,可知該體系對組分濃度變化的容忍尺度大,滿足實際需要。PCR循環(huán)數(shù)梯度實驗表明,循環(huán)數(shù)在28～30次之間,可得到完整分型,且熒光值隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,擴增均衡性較好。當(dāng)循環(huán)數(shù)大于等于31次時,會出現(xiàn)個別等位基因的熒光滲透,但擴增均衡性仍較好。因此,實際應(yīng)用時,可依據(jù)樣本模板量在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)PCR的循環(huán)次數(shù)。該體系在退火溫度58℃～62℃之間均可得到可靠結(jié)果。60℃時產(chǎn)物片斷熒光峰值和特異性最好。當(dāng)該體系終延伸時間設(shè)置為30min時,可以最大程度的減小各等位基因A肩峰。綜上所述,依據(jù)SWGDAM驗證指南,19個X-STR熒光檢測體系符合法醫(yī)實踐的要求。在群體多態(tài)性調(diào)查方面,19個X-STR基因座在國內(nèi)河南漢族、新疆維吾爾族、西藏藏族、寧夏回族、廣西壯族、廣西瑤族、廣西仫佬族八個民族共計2157份無關(guān)個體種檢測出353個等位基因,等位基因頻率范圍在0.0013～0.7094之間,最高的是廣西瑤族DXS10164的10等位基因;19個X-STR位點的遺傳多態(tài)性信息含量在0.4106～0.9277之間。不同人群中處于連鎖不平衡狀態(tài)的配對基因座不同,可位于同一連鎖簇、亦可位于不同連鎖簇,且并非同一連鎖簇內(nèi)的配對基因座均處于連鎖不平衡狀態(tài)。因此,配對基因座連鎖不平衡狀態(tài)既與物理距離和遺傳距離相關(guān),又與群體遺傳結(jié)構(gòu)相關(guān)。19個X染色體STR基因座作為七個連鎖簇聯(lián)合應(yīng)用時,該體系在把八個民族人群中的女性累積個體識別力均達到1.000 000 000 000 000,男性累積個體識別力在0.999 999 999 402265~0.999 999 999 996 670 之間,累計三聯(lián)體排除率在 0.999 999 999 188144~0.999 999 999 995 949 之間,累計二聯(lián)體排除率在 0.999 999 942 863498~0.999 999 999 638 495之間,均有著較高的個體識別力和非父排除力可為法醫(yī)實踐提供有價值的信息。在本研究八個民族人群的遺傳關(guān)系分析中,藏族、維吾爾族分為一支,與其他六個民與其他民族遺傳關(guān)系較遠。河南漢族、浙江漢族、寧夏回族、廣西壯族、廣西仫佬族遺傳關(guān)系較近。廣西三個民族與寧夏回族分于一支,但是廣西瑤族與另外三個民族遺傳關(guān)系較遠,可能與采樣地點偏遠有關(guān)。同時,在與日本人、非洲黑人、歐洲高加索人的遺傳關(guān)系分析中,可得出人種間的遺傳關(guān)系差異。結(jié)論本研究選取的19個X-STR熒光檢測體系有較好的靈敏度、種屬特異性、混合樣本檢驗?zāi)芰?重復(fù)性、一致性好,分型準(zhǔn)確。該體系在八個民族人群的累積個體識別力和非父排除率滿足實際應(yīng)用需要,可以為復(fù)雜親權(quán)鑒定和混合樣本檢驗提供有效技術(shù)手段。對八個民族人群進行多態(tài)新性調(diào)查,為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用和群體遺傳研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
【圖文】：

圖１－１法醫(yī)學(xué)常用的Ｘ－ＳＴＲ基因座逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｍｏｎｌｙ邋ｕｓｅｄ邋Ｘ－ＳＴＲｓ邋ｉｎ邋ｆｏｒｅｎｓｉｃ邋ｓｃｉｅｎｃ?

ＤＮＡ９９４７ａ、９９４８進行擴增電泳。５２份樣本在兩個擴增體系的６個重合基因座逡逑（ＤＸＳ７４２４、ＤＸＳ８３７８、ＤＸＳ６７８９、ＤＸＳ１０１５９、ＤＸＳ１０１、ＤＸＳ７４２３）得出相逡逑同的基因分型，，例ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＤＮＡ９９４７ａ和９９４８見圖２－６，表明１９個Ｘ－ＳＴＲ熒光逡逑檢測系統(tǒng)分型數(shù)據(jù)可靠
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：D919

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本文編號：2674670