【摘要】：目的:在世界范圍內(nèi),飲酒是人們一種普遍的社會行為。人們因飲酒給國家、社會、家庭及個(gè)人帶來的沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會危害。特別是飲酒會對人的生命健康構(gòu)成非常嚴(yán)重的威脅。WHO發(fā)布的2018年飲酒和健康報(bào)告(《Global status report on alcohol and health 2018》)指出每年約300萬人死于飲酒,占全球所有死亡人數(shù)的5.3%。在法醫(yī)鑒定中,因飲酒引起的急、慢性中毒和死亡以及與飲酒相關(guān)的案例占有相當(dāng)比例。越來越多的研究表明,許多疾病,特別是神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展,都與飲酒相關(guān)。盡管如此,涉酒人群依然龐大,同時(shí)越來越趨向年輕化,酒對人類的威脅日趨嚴(yán)重。作為飲用酒水中的主要成分,乙醇(ethanol,EtOH),俗稱酒精,屬一種有機(jī)化合物,能夠透過血腦屏障(blood brain barrier,BBB),直接作用于腦神經(jīng)細(xì)胞。長期慢性乙醇中毒引起神經(jīng)損害,導(dǎo)致韋尼克腦病(Wernicke腦病)、柯薩科夫綜合征(Korsakoff綜合征)、慢性酒精中毒性癡呆、酒精性精神和行為障礙等,其中以認(rèn)知功能障礙最為廣泛。乙醇的確切毒理學(xué)機(jī)制還不是完全清楚。乙醇通過許多機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的退化及凋亡,其中細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)超載誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是特別重要的一條通路,也是多種機(jī)制最終匯集的共同途徑。細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)超載將激活鈣敏感蛋白,包括如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase 3)和鈣蛋白酶1(calpain-1)凋亡相關(guān)因子,啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。另外,過量的Ca~(2+)還能影響線粒體ATP合成,破壞DNA結(jié)構(gòu)。鈣離子是機(jī)體內(nèi)的重要離子,它對維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶方面具有十分重要的意義。通常細(xì)胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度很低,約10~(-7)~10~-88 mol/L;細(xì)胞間液Ca~(2+)濃度較高,約5×10~(-3) mol/L。胞外的Ca~(2+)即使很少量涌入胞內(nèi)都會引起胞質(zhì)游離Ca~(2+)濃度顯著變化,導(dǎo)致一系列生理反應(yīng)。為維持細(xì)胞內(nèi)外的Ca~(2+)濃度平衡,細(xì)胞會把完成“信使”任務(wù)的Ca~(2+)通過質(zhì)膜上的鈣泵(calcium pump,PMCA)和鈉鈣交換體(Na~+/Ca~(2+)exchanger,NCX)排出細(xì)胞。鈣泵是一種質(zhì)膜單向鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體,特點(diǎn)是與Ca~(2+)的親和力強(qiáng),轉(zhuǎn)運(yùn)力較弱,主要負(fù)責(zé)在靜息狀態(tài)下發(fā)揮作用。與鈣泵不同,質(zhì)膜NCX對Ca~(2+)濃度變化非常敏感,它有九個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,對Ca~(2+)轉(zhuǎn)運(yùn)力非常高,是鈣泵的10-50倍。目前,在哺乳動(dòng)物身上共發(fā)現(xiàn)了3個(gè)亞型NCX1、NCX2和NCX3。NCX1廣泛表達(dá)在各個(gè)組織中,而NCX2和3只在腦和骨骼肌中表達(dá)。在腦中,NCX的三種亞型均有不同程度的分布和表達(dá)。NCX在細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)突然升高(達(dá)500 mM以上)時(shí)激活,啟動(dòng)Ca~(2+)轉(zhuǎn)運(yùn)模式,把細(xì)胞內(nèi)2/3以上的Ca~(2+)排出,NCX對神經(jīng)細(xì)胞興奮后Ca~(2+)大幅上升后迅速降低到基礎(chǔ)水平起著特別重要的作用。慢性乙醇暴露能引起人和動(dòng)物認(rèn)知功能障礙,神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)超載導(dǎo)致細(xì)胞退化和凋亡是其病理基礎(chǔ)。但是,為什么神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜NCX不能通過排出Ca~(2+)阻止乙醇誘導(dǎo)胞質(zhì)內(nèi)Ca~(2+)超載還未見相關(guān)的研究報(bào)道,也未見乙醇暴露后是否能夠引起NCX表達(dá)改變的研究。我們推測有可能是乙醇的促Ca~(2+)內(nèi)流速度大于NCX的排鈣速度,或者是乙醇通過某些機(jī)制抑制了NCX的表達(dá)使其不能充分發(fā)揮作用。針對慢性乙醇暴露誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中NCX的表達(dá)變化和功能異常的問題,本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察慢性乙醇暴露對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠認(rèn)知功能的影響、海馬神經(jīng)細(xì)胞的改變、NCX亞型表達(dá)變化以及它們之間的關(guān)聯(lián)性;同時(shí),采用細(xì)胞模型,觀察乙醇暴露誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞NCX1、NCX2和NCX3的表達(dá)變化情況,分析NCX亞型在慢性乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,探討慢性乙醇暴露誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的新的毒理學(xué)機(jī)制,也為慢性酒精中毒引起神經(jīng)損害的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和新途徑,為法醫(yī)學(xué)鑒定提供實(shí)驗(yàn)資料。研究方法:慢性乙醇暴露動(dòng)物實(shí)驗(yàn),采用C57BL/6雄性小鼠,分為30 d-CON組、30 d-10%EtOH組、30 d-20%EtOH組,60 d-CON組、60 d-10%EtOH組、60 d-20%EtOH組、90 d-CON組、90 d-10%EtOH組、90 d-20%EtOH組,每組10只。通過水迷宮觀察不同組小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙情況。至預(yù)設(shè)時(shí)間,稱重,乙醚麻醉后斷頸椎處死小鼠,取腦組織,應(yīng)用免疫組化觀察小鼠海馬中NCX亞型的分布和表達(dá)情況,應(yīng)用western blotting和qPCR觀察小鼠海馬中NCX1、NCX2、NCX3以及calpain-1,cleaved-caspase 3的表達(dá)、Akt的磷酸化水平和CREB1的表達(dá),分析NCX亞型的變化規(guī)律與慢性乙醇暴露后小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙之間的關(guān)系。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):乙醇組:1 d-CON、1 d-100 mM、1 d-200 mM、2 d-CON、2 d-100 mM、2 d-200 mM;以及在乙醇組基礎(chǔ)上加入LY294002、NaCl和分別沉默NCX1、NCX2和NCX3以后的對應(yīng)分組。應(yīng)用western blotting,觀察乙醇暴露不同時(shí)間NCX1、NCX2、NCX3、calpain1、caspase3、Akt、p-Akt、CREB1的表達(dá)變化,分析與乙醇暴露的關(guān)系;通過抑制Akt磷酸化通路觀察NCX亞型的變化以及對乙醇暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。利用siRNA技術(shù)分別沉默NCX1、NCX2、NCX3亞型后,觀察乙醇暴露后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,明確三種亞型分別在慢性乙醇暴露時(shí)具體發(fā)揮的作用。對發(fā)揮主要作用的NCX亞型進(jìn)行過表達(dá),觀察其對乙醇暴露誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,從正反兩方面證實(shí)其作用。研究結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn):慢性乙醇暴露后小鼠的空間記憶能力隨著暴露時(shí)間的延長和乙醇濃度的加大而損害嚴(yán)重。小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子cleaved-caspase 3和calpain-1的表達(dá)隨乙醇暴露的時(shí)間延長和劑量增加而增加。小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中NCX三種亞型均有表達(dá)。短時(shí)間乙醇暴露使NCX1的表達(dá)上調(diào),10%EtOH組上調(diào)明顯,在60 d和90 d EtOH組,NCX1的表達(dá)與CON組之間無顯著差異。NCX2的表達(dá)在乙醇暴露30 d時(shí)隨濃度上升而上調(diào),乙醇暴露60 d、90 d時(shí),NCX2的表達(dá)與CON組之間無顯著差異;NCX3的表達(dá)具有明顯的規(guī)律性,在乙醇暴露30d時(shí),10%EtOH組表達(dá)水平最高,CON組和20%EtOH組沒有顯著區(qū)別。隨著暴露時(shí)間的延長和乙醇濃度是提高,NCX3的水平出現(xiàn)明顯的下調(diào);NCX3免疫組化染色見30 d組10%EtOH組小鼠海馬的CA1、CA3和DG區(qū)的NCX3陽性表達(dá)較高,20%EtOH組內(nèi)NCX3的陽性細(xì)胞數(shù)相比CON組明顯減少。乙醇暴露60-90 d,小鼠海馬的CA1、CA3和DG區(qū)NCX3陽性細(xì)胞數(shù)和強(qiáng)度隨時(shí)間和劑量顯著下調(diào),細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,以CA3區(qū)的改變嚴(yán)重。NCX3上游的Akt磷酸化水平和CREB1的水平與NCX3的表達(dá)趨勢一致。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明乙醇暴露促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)的上升和細(xì)胞凋亡的增加,凋亡相關(guān)因子caspase 3和calpain-1表達(dá)增強(qiáng);高濃度乙醇對NCX1的表達(dá)先促進(jìn)后抑制,低濃度乙醇對NCX1具有緩慢促表達(dá)作用。隨著乙醇濃度的增加和暴露時(shí)間的延長,NCX2的表達(dá)逐漸增強(qiáng);NCX3也是隨著乙醇濃度的增加和暴露時(shí)間的延長而表達(dá)增強(qiáng)。Akt的磷酸化程度在乙醇暴露1 d時(shí)隨濃度增加而增強(qiáng),在2 d時(shí)明顯回落。當(dāng)用LY294002抑制Akt的磷酸化途徑后,NCX1和NCX3的表達(dá)降低,乙醇的促細(xì)胞凋亡作用增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)超載嚴(yán)重。利用siNCX分別下調(diào)了NCX1、NCX2和NCX3的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCX1對短時(shí)間暴露在乙醇環(huán)境下的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用,對長期暴露效果差;下調(diào)NCX2可能因?yàn)榇鷥斝陨险{(diào)了NCX3水平而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的效果。沉默NCX3直接導(dǎo)致暴露在乙醇環(huán)境下的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca~(2+)熒光信號明顯增強(qiáng),凋亡因子cleaved-caspase 3和calpain-1的表達(dá)顯著上調(diào),細(xì)胞凋亡率增加。當(dāng)過表達(dá)NCX3后,發(fā)現(xiàn)暴露在乙醇中的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度明顯降低。提高暴露在乙醇環(huán)境下神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基中的Na~+濃度,神經(jīng)細(xì)胞的凋亡程度明顯減輕,其機(jī)制是通過上調(diào)NCX3的表達(dá)所實(shí)現(xiàn),當(dāng)下調(diào)NCX3水平后,提高細(xì)胞外Na~+濃度不能起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。結(jié)論:1、慢性乙醇暴露導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力障礙;2、慢性乙醇暴露引起小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞NCX3表達(dá)降低與小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有關(guān);3、慢性乙醇暴露可引起小鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷,以CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞受損最為嚴(yán)重;4、NCX3蛋白表達(dá)變化有望為慢性乙醇中毒引起神經(jīng)損害的病理學(xué)診斷提供參考;5、NCX3表達(dá)增強(qiáng)能抑制慢性乙醇暴露誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞外鈉離子濃度有望作為乙醇引起的神經(jīng)細(xì)胞損害的治療靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1. 水迷宮逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)A: 逃避潛伏期 30 d：10% EtOH 和 20% EtOH 組小鼠尋找平臺的平均耗時(shí)要高于 CON 組。實(shí)驗(yàn)第 3 天和第 4 天 20% EtOH 組與 CON 組有顯著差異（*P<0.05）；20% EtOH 組的平均耗時(shí)高 10% EtOH 組；B: 逃避潛伏期 60 d：CON 組小鼠在 1-4 天比較中，耗時(shí)越來越少；EtOH 組小鼠所需時(shí)間高于 CON 組，在第 2 天 20% EtOH 組和第 4 天的 10% EtOH 組、20% EtOH 組用時(shí)顯著多于 CON組（*P<0.05，**P<0.01）；C: 隱蔽平臺 90 d：在第 1-4 天的乙醇暴露組與 CON 組的小鼠尋找平臺所需時(shí)間均存在顯著差異（*P<0.05，**P<0.01）；第 2 天和第 3 天 20% EtOH 組與 10% EtOH 之間有顯著差異（#P<0.05）。同時(shí)，20% EtOH 組顯著低于 10% EtOH 組（#P<0.05）；在乙醇暴露 90 d 時(shí)，10%EtOH 組和 20% EtOH 組之間的小鼠空間探索次數(shù)沒有顯著差異，但與 CON 組比較進(jìn)一步下降（**P<0.01）。采用單因素方差分析，，*P <0.05和**P <0.01同CON組相比，#P <0.05同10%EtOH相比。

圖 2. 水迷宮空間探索A：不同處理?xiàng)l件下小鼠在 60 秒內(nèi)穿越平臺區(qū)的軌跡圖。B:各組小鼠空間探索次數(shù)統(tǒng)計(jì)。30 d、60 d 和 90 d EtOH 處理組的小鼠隨著乙醇濃度的升高穿越平臺次數(shù)逐漸減少（*P <0.05，**P<0.01）；在乙醇暴露 30 d 和 60 d 時(shí)，小鼠穿越平臺的次數(shù)與乙醇濃度呈負(fù)相關(guān)，20% EtOH 與 10% EtOH 之間有顯著差異（#P<0.05）。采用單因素方差分析，*P <0.05 和**P <0.01 同 CON 組相比，#P <0.05 同 10%EtOH 相比。3.3 慢性乙醇暴露誘導(dǎo)小鼠海馬組織calpain-1和cleaved-caspase 3的表達(dá)上調(diào)慢性乙醇暴露 30 d，小鼠海馬組織內(nèi)凋亡相關(guān)因子 calpain-1 和 cleaved-caspase3 的表達(dá)上調(diào)。（圖 3.A）乙醇暴露 30 d 的 calpain-1 蛋白的 10% EtOH 和 20% EtOH組比 CON 組上調(diào)幅度分別為 198.5%和 354.5%。乙醇暴露 60 d，calpain-1 的表達(dá)更
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 張巖;程愛國;;神經(jīng)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)鈣離子生理病理機(jī)制[J];中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

本文編號：2660669