【摘要】：目的:在法醫(yī)實踐檢案中,常常遇到失蹤人口身份認(rèn)定、復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定等疑難案件,對這些案件的鑒定,通常需要檢測更多的遺傳標(biāo)記,獲得更多的遺傳信息。短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)仍然是目前法醫(yī)DNA分析主流的遺傳標(biāo)記,應(yīng)用毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建復(fù)合分型體系,目前可以做到一個體系中復(fù)合20多個STR位點,但仍不能滿足實際需求。下一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)不受熒光標(biāo)記限制可以在一個體系中檢測更多遺傳標(biāo)記,而且可以同時獲得各基因座的長度和序列信息,增加了STR的有效等位基因數(shù)目,提高了信息含量,是解決上述疑難案件的更好選擇。因此,本研究擬選取目前法醫(yī)DNA檢驗過程中常用的42個常染色體STR和Amelogenin基因構(gòu)建NGS-STR分型體系,基于Illumina MiSeq FGx~(TM)平臺進(jìn)行測序,建立測序數(shù)據(jù)的分析模塊和方法;對分型體系進(jìn)行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估,為NGS-STR分型技術(shù)的發(fā)展提供新數(shù)據(jù),為需要聯(lián)合應(yīng)用多個試劑盒的STR位點達(dá)到檢測目的疑難案件提供新的檢測方案。方法:1.NGS-STR分型體系構(gòu)建:從本課題組生物樣本庫中選取58個健康無關(guān)個人全基因組DNA樣本,選取2800 Control DNA作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品,使用Qubit~(TM) dsDNA HS Assay Kit進(jìn)行DNA定量,利用Nano-Q~(TM)微型分光光度計檢測DNA純度。選取法醫(yī)學(xué)常用的42個常染色體STR和Amelogenin基因(D1S1656、CSF1PO、D10S1248、D10S1435、D11S2368、D12S391、D13S317、D13S325、D14S608、D15S659、D16S539、D17S1290、D18S51、D18S535、D19S253、D19S433、D20S470、D21S11、D21S1270、D22-GATA198B05、D2S1338、D2S441、D3S1358、D3S1744、D3S3045、D4S2366、D5S2500、D5S818、D6S1043、D6S477、D7S1517、D7S3048、D7S820、D8S1132、D8S1179、D9S925、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX、vWA、Amelogenin),采用下一代測序的分子條形碼及單端特異性引物延伸技術(shù)合成NGS-STR分型體系分型試劑。按照QIAseq Targeted DNA Custom Panel說明構(gòu)建文庫,DNA起始模板量為20 ng,純度為1.8~2.0。應(yīng)用MiSeq上機測序試劑盒對文庫進(jìn)行均一化、變性和稀釋。使用Illumina Experiment Manager(IEM)進(jìn)行上機測序參數(shù)設(shè)置,運用MiSeq FGx~(TM)平臺的RUO(Research Use Only Run)模式進(jìn)行測序。2.測序數(shù)據(jù)分析:運用Linux系統(tǒng)與hg19版本參考基因組進(jìn)行序列比對,選取STR兩端長度3~10bp不等的特異序列進(jìn)行匹配和篩選目標(biāo)區(qū)域序列信息,且每個STR基因座的特異性匹配篩選標(biāo)準(zhǔn)較為個性化。通過對國際法醫(yī)遺傳學(xué)會的命名指南推薦命名進(jìn)一步調(diào)整,使其與CE分型結(jié)果間具有兼容性。3.NGS-STR分型體系法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估:比較同一文庫在不同參數(shù)(雙端測序(Pair-End,PE)PE150和PE300)下的進(jìn)行測序參數(shù);對2800 Control DNA中42個STR和Amelogenin基因的核心序列進(jìn)行測序驗證,評估分型結(jié)果的準(zhǔn)確性;比對58個樣本的NGS-STR和CE-STR分型結(jié)果,評價其一致性;對2800 Control DNA重復(fù)3次構(gòu)建文庫進(jìn)行重復(fù)性研究;將2800 Control DNA以不同起始DNA模板量(10 ng、5 ng、2.5 ng、1.25ng和0.625 ng)構(gòu)建文庫并上機測序評估靈敏度;將2個樣本以不同混合比(1:1、1:2、1:4和1:9)構(gòu)建文庫并上機測序進(jìn)行混合樣本研究。結(jié)果:1.實驗過程質(zhì)量評估對所構(gòu)建的文庫進(jìn)行片段質(zhì)檢結(jié)果表明,文庫既沒有小片段接頭也沒有大片拖尾峰,與預(yù)期峰圖一致;摩爾濃度質(zhì)檢結(jié)果表明,空白對照孔CT值29、標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率在-3.1~-3.5、復(fù)孔間的標(biāo)準(zhǔn)差0.4、擴(kuò)增效率在90%~110%,質(zhì)檢合格。本實驗過程中的3次測序的主要質(zhì)控指標(biāo)堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Quality Score)Q30、簇密度(cluster density)和簇通過率(Clusters Passing Filter)平均值分別為85.47%、1007.33 K/mm~2和91.5%,均滿足Illumina官方認(rèn)定可用結(jié)果。同一文庫采用雙端(Pair-End,PE)150測序和PE300兩種參數(shù)測序,結(jié)果表明,兩次測序分型結(jié)果完全一致。同時,在其他條件不變的情況下,隨著雙端測序讀長PE增加,測序可用數(shù)據(jù)相對增加。2.NGS-STR分型體系的實驗室評估在5%的分析閾值下,能過濾掉絕大多數(shù)的背景噪音并進(jìn)行正確分型,所有樣本平均總測序深度為147207×;基因座的平均DoC為2688×;在基因座序列構(gòu)成比中,%Allele、%Stutte、%Noise平均值分別為97.01%、2.64%、0.35%;所有基因座ACR平均值為0.741。3.準(zhǔn)確性和一致性該分型體系對2800 Control DNA的所有基因座的核心序列信息檢測結(jié)果與ForenSeq~TMM DNA Signature Prep Kit測序和Sanger測序結(jié)果一致。對2800 Control DNA測序結(jié)果研究發(fā)現(xiàn),9個常染色體STR基因座的NGS-STR分型和CE-STR分型的命名存在不兼容現(xiàn)象,根據(jù)序列比對結(jié)果對這些基因座進(jìn)行了核心序列的重復(fù)次數(shù)修正,提出了新的命名策略。按照新的命名策略進(jìn)行命名,本實驗58個樣本的2494個基因座進(jìn)行NGS-STR分型和CE-STR分型比對,2487個(99.72%)基因座的NGS和CE分型結(jié)果完全一致。同時,在23個基因座中觀察到新增同等位基因191個。4.重復(fù)性和靈敏度研究3次重復(fù)性實驗等位基因分型一致,并且%Allele和ACR經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗均無顯著性差異,表明分型體系重復(fù)性良好。在5%的分析閾值下,起始DNA模板量降至2.5 ng時,可以對各基因座進(jìn)行準(zhǔn)確分型。當(dāng)起始模板量為1.25 ng時,樣本的測序深度、%Allele出現(xiàn)了銳減現(xiàn)象,%Stutter和%Noise呈現(xiàn)反向增加的趨勢。對不同起始模板量ACR分析,當(dāng)起始模板量在2.5 ng時,ACR變異系數(shù)相對較小(20.8%);當(dāng)起始模板量降至0.625 ng時,變異系數(shù)增高到41.1%,各基因座間的離散程度增大。5.混合物分析在5%的分析閾值下,混合比為1:1和1:2的樣本沒有發(fā)生等位基因的丟失;混合比為1:4和1:9的樣本中均出現(xiàn)了低組分等位基因丟失現(xiàn)象。并且隨著樣本混合比的增大,呈現(xiàn)出等位基因檢出數(shù)目減少、丟失數(shù)目增多、檢出率降低的趨勢。6.群體遺傳學(xué)分析對58個無關(guān)個體NGS-STR分型數(shù)據(jù)進(jìn)行群體遺傳學(xué)參數(shù)分析,所有基因座的等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡,各基因座均呈連鎖平衡狀態(tài)。對長度多態(tài)性和序列多態(tài)性所獲得的雜合度Het、個人識別概率DP和多態(tài)性信息含量PIC進(jìn)行比較,表明通過NGS檢測STR的多態(tài)性較CE結(jié)果有明顯的提高。結(jié)論:本研究構(gòu)建了42個常染色體STR和Amelogenin基因的NGS-STR分型體系、測序數(shù)據(jù)分析方法及命名策略,具有較好的準(zhǔn)確性、靈敏度和重復(fù)性,對混合樣本分型具有較好的應(yīng)用價值,為NGS-STR分型技術(shù)的發(fā)展提供新數(shù)據(jù),為需要聯(lián)合應(yīng)用多個試劑盒的STR位點達(dá)到檢測目的疑難案件提供新的檢測方案。
【圖文】：

文庫構(gòu)建流程

LabchipGxTouch24文庫質(zhì)檢結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉秋玲;梁艷芳;呂德堅;趙虎;;Powerplex~ 16~(TM) System在中國人群中OL等位基因的研究[J];中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版);2009年S1期

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本文編號：2651025