【摘要】：背景和目的隨著中國載人航天事業(yè)的不斷發(fā)展,空間站的建設(shè)提上了日程,進入外太空的航天員會越來越多,并且在軌飛行時間會越來越長,太空環(huán)境對航天員的健康影響越來越成為醫(yī)監(jiān)醫(yī)保工作的重點。失重,作為太空環(huán)境中的一個重要而且無法避免的因素,對生物體的影響廣泛而且復(fù)雜,甲狀腺也不例外。mi RNA(micro RNA)是一類21-25nt長的高度保守的小分子非編碼RNA,它幾乎參與了機體所有的生理和病理過程。本實驗采用旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(Rotating Cell Culture System,RCCS)模擬微重力環(huán)境的方法,研究大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞FRTL-5在模擬微重力條件下mi RNA的表達譜變化,并分析其靶基因的相關(guān)功能與細胞通路,為失重環(huán)境下生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化提供理論依據(jù)。研究方法(1)購置大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞FRTL-5細胞株,采用RCCS建立微重力培養(yǎng)體系,選取生長狀態(tài)良好的4-10代對數(shù)生長期細胞隨機分為兩組:正常重力組(normal gravity group,NG)和模擬微重力組(simulated microgravity group,SMG),每組3個樣本,每個樣本均培養(yǎng)24小時。提取樣本總RNA,進行熒光標記和芯片雜交。采用Feature Extraction軟件處理雜交圖像提取原始數(shù)據(jù),應(yīng)用Genespring軟件進行分位數(shù)標準化和后續(xù)處理,篩選差異表達顯著的mi RNA,將表達變化倍數(shù)與對照組相比較在2倍以上,并且在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著差異(p0.05)的mi RNA確定為差異mi RNA。選取差異顯著同時原始信號值較強的數(shù)個mi RNA進行q RT-PCR驗證,從而驗證芯片結(jié)果的可靠性。(2)針對本研究第一階段篩選出的mi RNA,通過mi RNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,對預(yù)測靶基因分別進行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,判定差異mi RNA主控的生物學(xué)過程和信號通路,對關(guān)鍵mi RNA的功能進行初步預(yù)測。結(jié)果(1)研究發(fā)現(xiàn),大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞FRTL-5在RCCS模擬微重力環(huán)境條件下,mi RNA表達譜發(fā)生明顯變化,篩查共有81個差異表達的mi RNA,相較于NG組細胞SMG組53個明顯上調(diào),28個明顯下調(diào)。對差異表達顯著且原始信號值較高的3條mi RNA進行實時熒光定量PCR驗證,定量PCR結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致。(2)對模擬微重力環(huán)境下大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞差異表達的mi RNA進行靶基因預(yù)測,進一步GO分析顯示這些差異mi RNAs主要參與了老化、凋亡、對低氧的反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、細胞粘附及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。通過pathway分析顯示,差異表達的mi RNA主要參與有低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路、c GMP-PKG信號通路、Fox O信號通路及多種甲狀腺激素調(diào)節(jié)通路相關(guān)通路,如NF-κB信號通路、MAPK信號通路、Notch信號通路等。結(jié)論Agilent mi RNA芯片技術(shù)可高效、準確的對差異mi RNA進行篩選;微重力環(huán)境下大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞mi RNA表達譜發(fā)生顯著變化;基于芯片技術(shù)的mi RNA靶基因預(yù)測和功能富集分析可為失重應(yīng)激損傷機制和修復(fù)措施的研究提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。
【圖文】：

符合實驗要求。表 5 樣品檢測結(jié)果Tab 5 Sample test results號濃度（μg/μl）A260/280 A260/230體積(μl)總量（μg）210028S/18S 1 0.1851 2.06 0.98 10 1.85 0.7 2 0.1210 2.04 1.80 10 1.21 0.7 3 0.1634 2.05 0.59 10 1.63 0.7 1 0.0939 2.03 1.80 10 0.94 2.2 2 0.0768 2.05 1.19 20 1.54 2.3 3 0.1020 1.97 0.78 10 1.02 2.4

芯片檢測結(jié)果miRNA表達在微重力組中與正常重力組中的變化倍數(shù)在2倍以上并P＜0.05）的基因，確定為差異性表達的 miRNA，，共 81 條，其中 2 調(diào)的 miRNA 共 53 條，2 倍以上表達降低的共 28 條。芯片雜交掃描圖片雜交后經(jīng)掃描得到的熒光強度圖，可反映芯片雜交狀況，圖中的、清晰度，致密度及均勻度與雜交情況呈正比。本次實驗結(jié)果顯示清晰度、均勻度均較好（如圖 2 所示），雜交狀況滿意。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R852.22

【參考文獻】

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1 宋向衛(wèi);王占宇;姜玉峰;徐冰心;司少艷;周金蓮;楊鶴鳴;李成林;崔彥;;模擬微重力對小鼠成纖維細胞miRNA表達的影響[J];中華創(chuàng)傷雜志;2017年08期

2 丁金旺;王克義;李琛;時晶晶;葉柳青;羅定存;;miRNA在甲狀腺乳頭狀癌中的研究新進展[J];中華內(nèi)分泌外科雜志;2016年01期

3 王孟丹;劉小娜;魏立民;;甲狀腺激素對肝脂代謝調(diào)節(jié)及相關(guān)非經(jīng)典通路的研究進展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2015年20期

4 馮紹華;邢雙;楊立順;趙樹s

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