【摘要】：核酸是生物遺傳信息載體,其完整性對生物生存和正常繁衍至關(guān)重要。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)和基因損傷的分析檢測在當前生化研究和臨床診斷等領域具有重要的意義,開發(fā)簡便、快速、高靈敏和特異性好的核酸檢測新方法具有廣泛的應用前景。論文主要應用環(huán)介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、毛細管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)等技術(shù),研究開發(fā)了高靈敏度檢測DNA SNP和氧化損傷水平的新方法,并在耐力水平評價、運動遺傳病預防等多個體育科研領域中的應用進行了研究,主要內(nèi)容如下:1、基于連接酶LAMP技術(shù)建立了檢測運動員耐力杰出型基因ACTN3 SNP的新方法。方法設計了與目標DNA序列互補的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針,利用探針連接反應引發(fā)LAMP反應,采用SBYR Green I染料對雙鏈DNA進行實時熒光定量檢測,根據(jù)POI值(實時熒光曲線中的最大斜率對應的時間)差異實現(xiàn)ACTN3基因SNP的高靈敏度分型。此方法對DNA定量檢出限為100 aM,可測定0.1%突變頻率,同時應用于人全血基因組DNA樣品檢測獲得了與DNA測序一致的結(jié)果。2、基于上述連接酶LAMP原理,采用CE實現(xiàn)在單個反應體系中同時檢測多個耐力基因的SNP位點。在反應過程中,在一條引物上標記熒光基團;針對不同SNP位點,設計具有不同長度的連接探針,連接反應準確區(qū)分堿基錯配,LAMP反應后產(chǎn)物進行酶切,熒光產(chǎn)物通過SeqStudio~(TM)基因分析儀的CE分離和激光誘導熒光檢測,進行片段分析,根據(jù)不同長度的熒光產(chǎn)物來進行4種SNP類型的區(qū)分,方法對DNA檢出限低至2 aM。3、基于陽離子共軛聚合物PFP FRET原理建立了一種檢測DNA氧化損傷水平的新方法。該方法通過DNA修復酶處理氧化損傷DNA樣品獲得3'-5'磷酸核苷酸間隙,用DNA聚合酶標記熒光,再加入PFP獲得PFP-DNA復合物,通過FRET檢測DNA的氧化損傷水平。實驗結(jié)果表明,該方法具有較高的靈敏度和特異性,人基因組DNA的檢出限為1ng/μL。與現(xiàn)有方法相比,該方法解決了DNA損傷檢測步驟繁瑣、靈敏度低、選擇性低的缺點,在臨床醫(yī)學檢測中具有良好的應用前景。
【圖文】：

第一章 引 言運動員和普通人群中分布特征，分析基因多態(tài)性與長跑訓練前后生理指性，利用基因重組和細胞轉(zhuǎn)染研究 Glut4 基因啟動子區(qū)與有氧能力關(guān)聯(lián)的帶不同等位基因的啟動子，分析其與長跑能力相關(guān)性。實驗結(jié)果表明，Ars2796516 位點 G 等位基因、rs2746342-rs11206889 位點 AC 單體型等基因跑運動員的分子標記。

圖 1-2 ACTN3 / 小鼠模型的建立及分析[34]大有氧耐力的遺傳度為 30%-80%，至今共發(fā)現(xiàn) 49 個與耐力素質(zhì)部分位點由于受樣本量、種族差異、地域差異等影響，其確切效們普遍認為，基因突變可能在很大程度上可以解釋人體有氧能力肉力量、有氧能力類型、體成分和不同基因的多態(tài)性有顯著相關(guān)
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;R87

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