發(fā)布時(shí)間：2020-04-18 03:47

【摘要】：核酸是生物遺傳信息載體,其完整性對(duì)生物生存和正常繁衍至關(guān)重要。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)和基因損傷的分析檢測(cè)在當(dāng)前生化研究和臨床診斷等領(lǐng)域具有重要的意義,開發(fā)簡(jiǎn)便、快速、高靈敏和特異性好的核酸檢測(cè)新方法具有廣泛的應(yīng)用前景。論文主要應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis,CE)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)等技術(shù),研究開發(fā)了高靈敏度檢測(cè)DNA SNP和氧化損傷水平的新方法,并在耐力水平評(píng)價(jià)、運(yùn)動(dòng)遺傳病預(yù)防等多個(gè)體育科研領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了研究,主要內(nèi)容如下:1、基于連接酶LAMP技術(shù)建立了檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員耐力杰出型基因ACTN3 SNP的新方法。方法設(shè)計(jì)了與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針,利用探針連接反應(yīng)引發(fā)LAMP反應(yīng),采用SBYR Green I染料對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè),根據(jù)POI值(實(shí)時(shí)熒光曲線中的最大斜率對(duì)應(yīng)的時(shí)間)差異實(shí)現(xiàn)ACTN3基因SNP的高靈敏度分型。此方法對(duì)DNA定量檢出限為100 aM,可測(cè)定0.1%突變頻率,同時(shí)應(yīng)用于人全血基因組DNA樣品檢測(cè)獲得了與DNA測(cè)序一致的結(jié)果。2、基于上述連接酶LAMP原理,采用CE實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐力基因的SNP位點(diǎn)。在反應(yīng)過(guò)程中,在一條引物上標(biāo)記熒光基團(tuán);針對(duì)不同SNP位點(diǎn),設(shè)計(jì)具有不同長(zhǎng)度的連接探針,連接反應(yīng)準(zhǔn)確區(qū)分堿基錯(cuò)配,LAMP反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行酶切,熒光產(chǎn)物通過(guò)SeqStudio~(TM)基因分析儀的CE分離和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè),進(jìn)行片段分析,根據(jù)不同長(zhǎng)度的熒光產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行4種SNP類型的區(qū)分,方法對(duì)DNA檢出限低至2 aM。3、基于陽(yáng)離子共軛聚合物PFP FRET原理建立了一種檢測(cè)DNA氧化損傷水平的新方法。該方法通過(guò)DNA修復(fù)酶處理氧化損傷DNA樣品獲得3'-5'磷酸核苷酸間隙,用DNA聚合酶標(biāo)記熒光,再加入PFP獲得PFP-DNA復(fù)合物,通過(guò)FRET檢測(cè)DNA的氧化損傷水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法具有較高的靈敏度和特異性,人基因組DNA的檢出限為1ng/μL。與現(xiàn)有方法相比,該方法解決了DNA損傷檢測(cè)步驟繁瑣、靈敏度低、選擇性低的缺點(diǎn),在臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。
【圖文】：

第一章 引 言運(yùn)動(dòng)員和普通人群中分布特征，分析基因多態(tài)性與長(zhǎng)跑訓(xùn)練前后生理指性，利用基因重組和細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究 Glut4 基因啟動(dòng)子區(qū)與有氧能力關(guān)聯(lián)的帶不同等位基因的啟動(dòng)子，分析其與長(zhǎng)跑能力相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ars2796516 位點(diǎn) G 等位基因、rs2746342-rs11206889 位點(diǎn) AC 單體型等基因跑運(yùn)動(dòng)員的分子標(biāo)記。

圖 1-2 ACTN3 / 小鼠模型的建立及分析[34]大有氧耐力的遺傳度為 30%-80%，至今共發(fā)現(xiàn) 49 個(gè)與耐力素質(zhì)部分位點(diǎn)由于受樣本量、種族差異、地域差異等影響，其確切效們普遍認(rèn)為，基因突變可能在很大程度上可以解釋人體有氧能力肉力量、有氧能力類型、體成分和不同基因的多態(tài)性有顯著相關(guān)
【學(xué)位授予單位】：河北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：O657.3;R87

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本文編號(hào)：2631682