【摘要】：【目的】研究正常細胞受電離輻射后分泌出外泌體(exosomes)中miR-1246等miRNA分子的表達變化及其進入未受照細胞中造成的基因組損傷效應和作用機制。【材料和方法】取對數(shù)期生長的正常人肺支氣管上皮細胞BEP2D,分為照射組和非照射組,給予2Gy的~(60)Co-γ照射,繼續(xù)培養(yǎng)4hr和8hr后收集無細胞培養(yǎng)液,超速離心法分離獲取外泌體,提取exosomes中的RNA,進行miRNA基因芯片檢測分析差異表達miRNA分子,選擇表達上調明顯的miR-1246進一步研究。采用受照細胞的條件培養(yǎng)液及外泌體轉移的方法,以微核(MN)、DNA雙鏈斷裂分子標志物53BP1 foci、彗星為生物終點檢測各處理因素誘導未受照支氣管上皮細胞BEP2D的基因組DNA損傷,據(jù)此了解外泌體介導的輻射旁效應。然后觀察經(jīng)轉染miR-1246的模擬物(mimic)或抑制劑,進一步考證外泌體miR-1246誘發(fā)細胞基因組DNA損傷,即微核(MN)、53BP1 foci、彗星等指標的變化;利用流式細胞術、CCK-8試劑盒、克隆形成檢測細胞凋亡及細胞增殖變化;TargetScan在線預測miR-1246的靶基因,對其中的靶基因——DNA雙鏈斷裂的非同源末端修復(NHEJ)通路中關鍵修復基因連接酶4(LIG4)作進一步的影響機制研究;實時定量PCR、Western blot分別在mRNA、蛋白水平上檢測miR-1246與LIG4的關系,雙熒光素酶報告基因檢測miR-1246與LIG4 mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)靶序列的直接相互作用;;利用轉染NHEJ-GFP、P-cherry質粒報告系統(tǒng)及流式細胞分析檢測miR-1246對NHEJ修復效率的影響,進一步探討miR-1246介導輻射誘導的細胞基因組損傷修復的相關機制。【結果】通過基因芯片分析,從2Gy照射BEP2D細胞的培養(yǎng)液中分離出外泌體中,鑒定了多個受輻射誘導表達的miRNA分子,其中包括miR-1246;相對于對照細胞的培養(yǎng)液,用2Gy照射細胞后4h、24h收集的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)RCCM正常的BEP2D細胞,誘發(fā)細胞微核、53BP1 foci、彗星形成率等基因組DNA損傷指標顯著增加。用照射細胞的外泌體處理正常細胞,同樣顯著增加細胞的基因組DNA損傷。。用miR-1246處理正常培養(yǎng)的BEP2D細胞,,也相應地顯著增加微核、53BP1 foci、彗星的產(chǎn)生,并且存在劑量效應,同時導致細胞增殖能力下降,但是其凋亡,周期未發(fā)生明顯變化。miR-1246抑制劑能夠顯著減輕受照細胞分泌外泌體和條件培養(yǎng)液RCCM的對未照射細胞的基因組DNA損傷效應;miR-1246 mimic在mRNA、蛋白水平抑制了細胞LIG4的表達,以及LIG4 mRNA 3’UTR活性,導致DNA雙鏈斷裂的NHEJ通路修復效率顯著降低�！窘Y論】電離輻射導致BEP2D細胞分泌的外泌體中miR-1246表達水平顯著增減,其進入未照射的細胞中誘發(fā)基因組DNA損傷,其作用機制與miR-1246靶向抑制DNA修復基因LIG4的表達密切相關。該研究為闡述電離輻射旁效應機制提供了新的機理解釋。
【圖文】：

圖 1 BEP2D 細胞分泌外泌體的電子顯微鏡下鑒定體中 miRNA 表達譜的變化射 BEP2D 細胞，在照射后 4h、8h 分別收集照射細胞和對體，進行了 miRNA 芯片分析。通過芯片篩查由輻射誘導A，發(fā)現(xiàn)細胞受照射后的外泌體中 miRNA 表達有升高的，，示外泌體中 miRNA 表達譜聚類分析的一部分 miRNA 分的是照射后 4h 和 8h 的外泌體中共同差異表達的 miRNANA-7-5p 和 miRNA-1246。表 1 列出了照射后 4h 表達水平具有統(tǒng)計學顯著性（p < 0.05）的 miRNA 分子，且受照細大于 500，共鑒定了 16 個表達顯著上調的 miRNA 分子

圖 3 qRT-PCR 檢測細胞內或外泌體 miR-1246 的表達變化A．2Gy 照射后不同時間點細胞內 miR-1246 的表達B. 2Gy 照射后不同時間點收集培養(yǎng)液提取外泌體中 miR-1246 的表達C. 不同時間點收集的外泌體被受體細胞攝取后 miR-1246 的表達3.5 輻射誘導外泌體 miR-1246 介導旁細胞基因組 DNA 損傷為了探索外泌體中的 miR-1246 介導旁細胞基因組損傷，我們用 2Gy 照BEP2D 細胞后分別在 4h、24h 收集培養(yǎng)液（RCCM），培養(yǎng)液轉移法培養(yǎng) BEP細胞，微核試驗檢測其旁基因組損傷。圖 4A 顯示，相對于未照射細胞的培養(yǎng)CCCM，來自受照細胞的條件培養(yǎng)液 RCCM 培養(yǎng)的 BEP2D 細胞的微核率顯著加。為了進一步證明 miR-1246 介導輻射誘導旁基因組損傷，2Gy 輻射細胞后集培養(yǎng)液，培養(yǎng)液轉移法后，轉染 miR-1246 inhibitor、miR-NC，微核試驗檢其旁基因組損傷情況，如圖 4B 顯示轉染 inhibitor 顯著抑制了 RCCM 所致 BEP
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R818

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本文編號：2630237