【摘要】：[目的]利用18SrDNA克隆文庫聯(lián)用掃描電鏡檢測滇池不同水域硅藻種群分布特征,用于法醫(yī)學(xué)溺死鑒定。[方法]應(yīng)用Power Soil DNA Isolation Kit提取滇池水樣中的硅藻DNA,然后針對滇池硅藻種群利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計硅藻18SrDNA引物,并與文獻(xiàn)報道的兩對硅藻18srDNA特異性引物A145F/Dia516R及通用性引物18sF/18sR,分別對滇池水域中的硅藻18srDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和測序檢測,并比較其特異性與敏感性,篩選出適合作為滇池水域的硅藻DNA擴(kuò)增及檢驗的備選引物。在滇池設(shè)立6個采集點(diǎn)采集水樣,用上步篩選的引物對滇池6個采水點(diǎn)水樣總DNAPCR擴(kuò)增,構(gòu)建硅藻18srDNA克隆文庫,隨機(jī)挑取克隆子進(jìn)行測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對,分析滇池硅藻種群分布。之后應(yīng)用掃描電鏡檢測滇池硅藻種群,對比兩種檢測方法的結(jié)果,并編集滇池水域硅藻種群掃描電鏡圖譜。[結(jié)果](1)Power Soil DNA Isolation Kit能夠有效提取水樣中的硅藻DNA,且DNA純度高,可直接用于下游實驗。(2)引物篩選,特異性強(qiáng)弱依次是605F/605R,467F/467R,18sF/18sR,A145F/Dia516R,其敏感性強(qiáng)弱依次是 605F/605R,18sF/18sR,467F/467R 和A145F/Dia516R。(3)18SrDNA克隆文庫檢測滇池6個采集點(diǎn)水樣,檢出冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬11個硅藻種屬。(4)掃描電鏡檢測滇池6個采集點(diǎn)水樣,檢出冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、彎楔藻屬、橋彎藻屬、卵形藻屬、針桿藻屬、平板藻屬14個硅藻種屬。[結(jié)論](1)試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit能夠有效提取水樣中的硅藻DNA,18SrDNA克隆文庫法用于水樣硅藻種群分析效果好,此法要用于水中尸體溺死診斷還需深入研究探索。(2)引物605F/605R適合作為滇池水域的硅藻DNA擴(kuò)增及檢驗的備選引物。(3)滇池全湖檢出15類硅藻,包括冠盤藻、等片藻、直鏈藻、菱形藻、小環(huán)藻、海鏈藻、脆桿藻、舟形藻、異極藻、曲殼藻、彎楔藻、橋彎藻、卵形藻、針桿藻、平板藻,不同水域硅藻種群存在一定差異。
【圖文】：

邐昆明醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第二部分１８ｓｒＤＮＡ克隆文庫解析滇池通過上一章對滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ引物的設(shè)計的引物６０５Ｆ／６０５Ｒ。本章將運(yùn)用該引物對滇池水域期獲得滇池水域硅藻種群多樣性的初步信息，對滇法醫(yī)學(xué)溺死診斷以及溺水地點(diǎn)推測提供參考，也為分子鑒定結(jié)果的一致性與差異性提供依據(jù)。逡逑１材料與方法逡逑１．１樣本采集逡逑１．邋１．１采樣時間與采集地點(diǎn)逡逑在滇池設(shè)置６個水樣采集點(diǎn)：海埂北側(cè)的草海觀音山（３）、東大河濕地公園（４）、撈魚河濕地公見圖５。采集時間：２０１７年３月２２日。逡逑

滇池６個采集點(diǎn)水樣運(yùn)用Ｐｏｗｅｒ邋Ｓｏｉｌ邋ＤＮＡ邋Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ試劑盒提取水樣逡逑總ＤＮＡ，并運(yùn)用滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ特異性引物６０５Ｆ／６０５Ｒ邋ＰＣＲ擴(kuò)增得到預(yù)期目標(biāo)逡逑片段，片段大小約４００ｂｐ，如圖６。逡逑２５０ｂｐ逡逑５00ｂｐ逡逑７５０ｂｐ逡逑ｌＯＯＯｂｐ逡逑圖６滇池６個水樣采集點(diǎn)硅藻１８ｓｒＤＮＡ擴(kuò)增結(jié)果逡逑（從左至右依次為：ｍａｋｅｒ，水樣１號至６號）逡逑２．邐２滇池硅藻種群多樣性逡逑６個硅藻１８ｓｒＤＮＡ克隆文庫各挑�。矗皞�克隆子載體引物擴(kuò)增測序，共獲得逡逑１９６個ＤＮＡ序列，通過Ｂｌａｓｔ與ＮＣＢＩ核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，按照相似度最近的逡逑藻類統(tǒng)計數(shù)據(jù)，，見表９。１９６個序列中有１６７個硅藻序列，包括冠盤藻屬、等片逡逑藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極逡逑藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬１１個娃藻種屬。６個米集點(diǎn)間檢出娃藻種群存在差逡逑異，海埂北側(cè)的草海水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、海鏈藻、舟形藻、菱形藻、脆桿逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：D919

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚綱;陳永紅;胡紅焱;張健鵬;;棒狀乳桿菌4個管家基因PCR引物的設(shè)計與驗證[J];中國醫(yī)學(xué)工程;2015年08期

2 鄧建強(qiáng);劉寶琴;龍仁;梁安文;李文慧;蔡繼峰;;硅藻COX-Ⅰ區(qū)種屬特異性PCR用于法醫(yī)學(xué)溺死診斷[J];川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2015年01期

3 施擇;李愛軍;張榆霞;鐵程;趙琦林;李穎;金玉;;滇池浮游藻類群落構(gòu)成調(diào)查[J];中國環(huán)境監(jiān)測;2014年05期

4 馬巍;浦承松;羅佳翠;陳欣;;滇池水動力特性及其對北岸藍(lán)藻堆積驅(qū)動影響[J];水利學(xué)報;2013年S1期

5 韓軍鴿;王程寶;李興彪;范琰琰;馮相平;;硅藻硝酸消化法與浮游生物16S rDNA PCR法在溺死鑒定中的比較[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2013年05期

6 馬書玲;李方明;高孟杰;馬延龍;紀(jì)星宇;;深井水中尸體臟器硅藻檢驗[J];河南科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年04期

7 張書田;卞戈;黃和鳴;陳乃寧;李軍;劉泓;鄭武;;福州晉安河水域浮游微藻種群18SrDNA分析[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2012年03期

8 尤超;趙大球;梁乘榜;周春華;;PCR引物設(shè)計方法綜述[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2011年17期

9 胡孫林;溫錦鋒;張小婷;方超;王松才;戴維列;劉超;;微波消解-掃描電鏡聯(lián)用檢測臟器內(nèi)硅藻[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2010年03期

10 劉兆;丁錳;徐少輝;;硅藻檢驗中應(yīng)注意的新問題[J];中國人民公安大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年03期

相關(guān)會議論文 前1條

1 趙建;劉超;胡孫林;溫錦鋒;石河;何樹文;;真空抽濾技術(shù)在法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗中的應(yīng)用[A];全國第九次法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 郭立亮;海洋微藻DNA條形碼基因的評估及環(huán)境樣本多樣性分析和定量基因的開發(fā)[D];中國海洋大學(xué);2015年

2 王會品;勒福特王水消解法檢驗硅藻的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 余政梁;PCR法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應(yīng)用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

2 董聲;真核藻類特異性PCR體系及其應(yīng)用[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2013年

3 周玉倩;硅藻18S rRNA鑒別實驗家兔水中尸體死因的研究[D];皖南醫(yī)學(xué)院;2013年

本文編號：2590781