發(fā)布時間：2020-03-19 22:05

【摘要】：[目的]利用18SrDNA克隆文庫聯(lián)用掃描電鏡檢測滇池不同水域硅藻種群分布特征,用于法醫(yī)學(xué)溺死鑒定。[方法]應(yīng)用Power Soil DNA Isolation Kit提取滇池水樣中的硅藻DNA,然后針對滇池硅藻種群利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計硅藻18SrDNA引物,并與文獻報道的兩對硅藻18srDNA特異性引物A145F/Dia516R及通用性引物18sF/18sR,分別對滇池水域中的硅藻18srDNA進行PCR擴增、克隆和測序檢測,并比較其特異性與敏感性,篩選出適合作為滇池水域的硅藻DNA擴增及檢驗的備選引物。在滇池設(shè)立6個采集點采集水樣,用上步篩選的引物對滇池6個采水點水樣總DNAPCR擴增,構(gòu)建硅藻18srDNA克隆文庫,隨機挑取克隆子進行測序,在NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對,分析滇池硅藻種群分布。之后應(yīng)用掃描電鏡檢測滇池硅藻種群,對比兩種檢測方法的結(jié)果,并編集滇池水域硅藻種群掃描電鏡圖譜。[結(jié)果](1)Power Soil DNA Isolation Kit能夠有效提取水樣中的硅藻DNA,且DNA純度高,可直接用于下游實驗。(2)引物篩選,特異性強弱依次是605F/605R,467F/467R,18sF/18sR,A145F/Dia516R,其敏感性強弱依次是 605F/605R,18sF/18sR,467F/467R 和A145F/Dia516R。(3)18SrDNA克隆文庫檢測滇池6個采集點水樣,檢出冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬11個硅藻種屬。(4)掃描電鏡檢測滇池6個采集點水樣,檢出冠盤藻屬、等片藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極藻屬、曲殼藻屬、彎楔藻屬、橋彎藻屬、卵形藻屬、針桿藻屬、平板藻屬14個硅藻種屬。[結(jié)論](1)試劑盒Power Soil DNA Isolation Kit能夠有效提取水樣中的硅藻DNA,18SrDNA克隆文庫法用于水樣硅藻種群分析效果好,此法要用于水中尸體溺死診斷還需深入研究探索。(2)引物605F/605R適合作為滇池水域的硅藻DNA擴增及檢驗的備選引物。(3)滇池全湖檢出15類硅藻,包括冠盤藻、等片藻、直鏈藻、菱形藻、小環(huán)藻、海鏈藻、脆桿藻、舟形藻、異極藻、曲殼藻、彎楔藻、橋彎藻、卵形藻、針桿藻、平板藻,不同水域硅藻種群存在一定差異。
【圖文】：

邐昆明醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第二部分１８ｓｒＤＮＡ克隆文庫解析滇池通過上一章對滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ引物的設(shè)計的引物６０５Ｆ／６０５Ｒ。本章將運用該引物對滇池水域期獲得滇池水域硅藻種群多樣性的初步信息，對滇法醫(yī)學(xué)溺死診斷以及溺水地點推測提供參考，也為分子鑒定結(jié)果的一致性與差異性提供依據(jù)。逡逑１材料與方法逡逑１．１樣本采集逡逑１．邋１．１采樣時間與采集地點逡逑在滇池設(shè)置６個水樣采集點：海埂北側(cè)的草海觀音山（３）、東大河濕地公園（４）、撈魚河濕地公見圖５。采集時間：２０１７年３月２２日。逡逑

滇池６個采集點水樣運用Ｐｏｗｅｒ邋Ｓｏｉｌ邋ＤＮＡ邋Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ試劑盒提取水樣逡逑總ＤＮＡ，并運用滇池硅藻１８ｓｒＤＮＡ特異性引物６０５Ｆ／６０５Ｒ邋ＰＣＲ擴增得到預(yù)期目標(biāo)逡逑片段，片段大小約４００ｂｐ，如圖６。逡逑２５０ｂｐ逡逑５00ｂｐ逡逑７５０ｂｐ逡逑ｌＯＯＯｂｐ逡逑圖６滇池６個水樣采集點硅藻１８ｓｒＤＮＡ擴增結(jié)果逡逑（從左至右依次為：ｍａｋｅｒ，水樣１號至６號）逡逑２．邐２滇池硅藻種群多樣性逡逑６個硅藻１８ｓｒＤＮＡ克隆文庫各挑取４０個克隆子載體引物擴增測序，共獲得逡逑１９６個ＤＮＡ序列，通過Ｂｌａｓｔ與ＮＣＢＩ核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，按照相似度最近的逡逑藻類統(tǒng)計數(shù)據(jù)，，見表９。１９６個序列中有１６７個硅藻序列，包括冠盤藻屬、等片逡逑藻屬、直鏈藻屬、菱形藻屬、小環(huán)藻屬、海鏈藻屬、脆桿藻屬、舟形藻屬、異極逡逑藻屬、曲殼藻屬、楔形藻屬１１個娃藻種屬。６個米集點間檢出娃藻種群存在差逡逑異，海埂北側(cè)的草海水樣檢出冠盤藻、小環(huán)藻、海鏈藻、舟形藻、菱形藻、脆桿逡逑２７逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：D919

【參考文獻】

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本文編號：2590781