【摘要】：電離輻射對男性生殖健康的影響,已受到了廣泛關(guān)注。睪丸作為對電離輻射高度敏感的器官,在接受一定劑量以上的電離輻射后會出現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)和功能損傷,引起精子發(fā)生障礙,健康精子數(shù)量顯著減少,從而形成暫時甚至永久不育[1]。目前普遍認(rèn)為精原細(xì)胞損傷是睪丸接受一定劑量以上射線輻照后生精障礙的重要原因[2],因此,闡明電離輻射所致精原細(xì)胞損傷的分子機制,有助于深入理解睪丸輻射損傷的發(fā)生機理。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)了一種特異性表達(dá)于小鼠睪丸組織的E3泛素連接酶—RNF146。泛素化是一種廣泛存在于真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,不同的E3泛素連接酶能夠作用于不同的蛋白底物,催化特定的氨基酸殘基被泛素分子標(biāo)記,進(jìn)而被蛋白酶體識別,特異性降解[3]。RNF146作為一種DNA損傷反應(yīng)蛋白,序列高度保守[4]。研究提示,RNF146能夠特異性識別結(jié)合凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF),促進(jìn)AIF發(fā)生泛素化修飾,進(jìn)而在胞質(zhì)中誘導(dǎo)其降解,修復(fù)各種因素引起的DNA損傷,抑制細(xì)胞的凋亡[5]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RNF146的表達(dá)水平與小鼠性腺發(fā)育密切相關(guān),在新生小鼠睪丸組織中RNF146表達(dá)極低,隨著性發(fā)育其表達(dá)水平迅速升高[4]。組織病理學(xué)研究顯示睪丸組織中RNF146主要定位于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中。RN F146在DN A復(fù)制非常活躍的睪丸組織中高表達(dá)的意義是什么?大劑量X線輻照后睪丸組織中RNF146表達(dá)下調(diào)對睪丸功能的影響如何?其分子機制是什么?上述問題的回答,有助于我們深入理解RNF146在睪丸輻照損傷進(jìn)程中的作用和意義。為此,我們進(jìn)行了下列兩部分研究工作:第一部分X射線輻照對小鼠睪丸損傷及RNF146表達(dá)的影響目的觀察不同劑量X射線輻照對正常小鼠睪丸組織形態(tài)和功能以及RNF146表達(dá)的影響。方法取成年雄性C57小鼠240只,隨機分為6組,每組40只,分別給予0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 G y X射線輻照,通過HE染色觀察不同劑量X射線輻照后16h、48h及45d小鼠睪丸組織形態(tài)變化;Tunel染色評價X射線輻照后16 h及48 h小鼠睪丸生精細(xì)胞的凋亡情況;q-PC R實驗檢測RN F146 16h和48 h m RN A的表達(dá);45d后雄鼠與雌鼠1∶2合籠,根據(jù)輻照后雄鼠致正常雌鼠的受孕情況評價輻照對小鼠生育能力的影響。取成年雄性C57小鼠50只,隨機分為5組:B la nk,2G y 16 h,2 G y 48 h,4 G y 16 h以及4G y 48 h,每組10只。所有小鼠全部摘取左側(cè)睪丸,-80℃凍存,術(shù)畢1周后分別給予0、2、4 Gy X射線輻照,輻照后16h和48h取小鼠右則對應(yīng)睪丸,Western-blot分析評價X射線輻照對小鼠睪丸組織中RNF146蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示,X射線輻照后16h,各組睪丸組織無明顯形態(tài)學(xué)改變;輻照后48h,1Gy組可見胞核深染、固縮及碎裂,2Gy以上劑量組睪丸組織出現(xiàn)生精細(xì)胞形態(tài)異常,數(shù)量減少;45天后2Gy以下輻射劑量睪丸組織組織形態(tài)變化不大,2Gy有明顯損傷,4Gy睪丸生精小管有嚴(yán)重的空管,管腔皺縮變小。合籠結(jié)果提示2Gy及以下輻射損傷對小鼠生育能力無明顯影響,4Gy輻照后小鼠生育能力顯著降低。Tunel染色提示4Gy射線輻照后睪丸細(xì)胞凋亡主要發(fā)生于外層的精原細(xì)胞及精母細(xì)胞。q-PCR、Western-blot實驗表明2Gy和4Gy射線輻照后48h RNF146表達(dá)水平整體出現(xiàn)下降趨勢。結(jié)論小鼠在接受2Gy以上劑量的X射線輻照后睪丸組織會出現(xiàn)損傷,且短期內(nèi)無法修復(fù),4Gy輻照后損傷嚴(yán)重,雄性小鼠絕育率高達(dá)96%,射線輻照誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡,同時伴隨著RNF146表達(dá)下調(diào)。第二部分X射線輻照誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞GC1凋亡及凋亡誘導(dǎo)因子AIF核轉(zhuǎn)位目的本實驗以GC1小鼠精原細(xì)胞為細(xì)胞模型,研究X射線輻照所引起的GC1小鼠精原細(xì)胞的凋亡及凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)細(xì)胞定位的變化。方法將對數(shù)生長期的精原細(xì)胞細(xì)胞株GC1,分別接種至培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中,分別給予0、3、6、9 Gy X射線輻照,通過溴脫氧尿苷(Brd U)摻入實驗檢測輻射對細(xì)胞增殖速率的影響;輻射后48 h,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察細(xì)胞核凝集情況,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測證胞質(zhì)及胞核中AIF蛋白定位的變化,Western blot分析細(xì)胞總蛋白、胞質(zhì)蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平、RNF146總蛋白的變化以及二者表達(dá)水平的相關(guān)性;通過慢病毒過表達(dá)GC1細(xì)胞中的RNF146,給予9Gy射線輻照,Western blot檢測驗證RNF146對AIF定位的影響。結(jié)果隨著輻射劑量的增加,GC1細(xì)胞增殖速率顯著減慢,細(xì)胞活性降低。6Gy及9 G y X射線輻照后全細(xì)胞提取物中A IF蛋白總量變化不大,但細(xì)胞核提取物中AIF顯著增多,即AIF出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。RNF146隨著射線劑量的增加表達(dá)降低,9Gy輻照組最明顯。過表達(dá)RNF146后,能夠抑制AIF的核轉(zhuǎn)位。結(jié)論X射線輻照能夠誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞發(fā)生凋亡,該過程中伴有AIF入核的現(xiàn)象,RNF146能夠抑制AIF核轉(zhuǎn)位。
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【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R818

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2472056