【摘要】：目的研究探討真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1,4E-BP1)在電離輻射致細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中尤其是G2/M檢查點和紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點的功能調(diào)節(jié)作用及機制。方法肝癌Hep G2細(xì)胞模型,經(jīng)60Coγ射線照射誘發(fā)DNA損傷,Western blot檢測4E-BP1總蛋白和T37/46位點磷酸化蛋白的表達水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期阻滯情況;分子克隆法構(gòu)建敲低4E-BP1表達的sh RNA干擾質(zhì)粒,采用慢病毒表達系統(tǒng)-脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建4E-BP1穩(wěn)定敲低的細(xì)胞系;細(xì)胞計數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線;磷酸化組蛋白H3/Ser10分子標(biāo)記物免疫標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來檢測M期細(xì)胞及G2/M檢查點功能;使用Nocodazole將對照細(xì)胞和4E-BP1敲低細(xì)胞同步化于有絲分裂的前中期,隨后去除Nocodazole,細(xì)胞進入G1期,來觀察敲低4E-BP1蛋白表達對紡錘體結(jié)構(gòu)檢查點和細(xì)胞有絲分裂進程的影響。結(jié)果Hep G2細(xì)胞在4Gy射線照射后4h、8h,4E-BP1的T37/46位點磷酸化水平升高,4E-BP1總蛋白表達含量基本不變,同時細(xì)胞周期監(jiān)測顯示4E-BP1磷酸化與細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯過程相關(guān)聯(lián),高峰是發(fā)生在照射后10~14h。敲低4E-BP1后,細(xì)胞的生長速度變慢,對0.5Gy、1Gy較低劑量照射的敏感性增加;4Gy 60Coγ射線照射后兩細(xì)胞系的G2/M檢查點均激活,但G2期阻滯的解除時間存在差別,照射后12h,轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的He La-shvector細(xì)胞的M期細(xì)胞比例為2.24%而轉(zhuǎn)染敲低4E-BP1蛋白質(zhì)粒的He La-sh4E-BP1細(xì)胞的M期細(xì)胞已上升到4.26%。PI3K激酶抑制劑降低4E-BP1蛋白的穩(wěn)定性。結(jié)論4E-BP1的T37/46位點磷酸化蛋白在60Coγ射線的誘導(dǎo)下表達上調(diào),敲低4E-BP1蛋白后細(xì)胞生長活力下降,對1Gy及以下的低劑量照射的敏感性增加,不影響G2/M檢測點的激活,但4E-BP1蛋白的低表達會引起細(xì)胞更快的退出電離輻射引起的G2/M期阻滯,4E-BP1蛋白穩(wěn)定性受PI3K激酶家族成員調(diào)控。
[Abstract]:Objective to investigate the function and mechanism of eukaryotic translation initiation factor 4E- binding protein-1 (e IF4E-binding protein 1 + 4E-BP1) in the response to DNA damage induced by ionizing radiation, especially at G 2 / M checkpoint and spindle structure checkpoint. Methods the expression levels of total 4E-BP1 protein and phosphorylated protein at T37 / 46 site were detected by, Western blot in Hep G2 cell model induced by 60Co 緯 -ray irradiation, cell cycle arrest was detected by flow cytometry, and the expression of 4E-BP1 total protein and phosphorylated protein at T37 / 46 site were detected by flow cytometry. The sh RNA interference plasmid with low 4E-BP1 expression was constructed by molecular cloning, the cell line of 4E-BP1 stable knockout was constructed by lentivirus expression system-liposome transfection, the cell growth curve was drawn by cell count method. The phosphorylated histone H3/Ser10 molecular marker was used to detect the function of M phase cells and G 2 / M checkpoint by flow cytometry. Nocodazole was used to synchronize control cells and 4E-BP1 knockout cells in the first and middle stages of mitosis and then remove Nocodazole, cells into G1 phase to observe the effect of low 4E-BP1 protein expression on spindle structural checkpoint and cell mitosis process. Results the phosphorylation level at T37 / 46 of 4E-BP1 was increased in Hep G2 cells at 4 h after 4Gy irradiation, and the expression of total 4E-BP1 protein was almost unchanged. At the same time, cell cycle monitoring showed that 4E-BP1 phosphorylation was associated with G _ 2 / M phase arrest, and the peak occurred at 10 ~ 14 h after irradiation. When 4E-BP1 was knocked down, the growth rate of the cells became slower, and the sensitivity of the cells to 0.5 Gy / 1 Gy irradiation was higher than that of low dose irradiation. The G2 / M checkpoint of the two cell lines was activated after 4Gy 60Co 緯 -irradiation, but the release time of G2 phase arrest was different. The proportion of M-phase cells in He La-shvector cells transfected with control plasmid was 2.24%, while that of He La-sh4E-BP1 cells transfected with low 4E-BP1 protein particles increased to 4E-. Stability of BP1 protein. Conclusion the expression of phosphorylated protein at site T37 / 46 of 4E-BP1 was up-regulated by 60Co 緯 -rays, and the cell growth activity decreased after knocking down the 4E-BP1 protein, and the sensitivity to low dose irradiation of 1Gy and below was increased, and the activation of G _ 2 / M detection point was not affected. However, the low expression of 4E-BP1 protein resulted in faster withdrawal of cells from G _ 2 / M phase arrest induced by ionizing radiation, and the stability of 4E-BP1 protein was regulated by members of PI3K kinase family.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R818

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李力;持續(xù)性DNA損傷和姊妹染色單體交換的細(xì)胞消失[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;1986年02期

2 張遵真,衡正昌;用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)檢測鉻和砷化物的DNA損傷作用[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;1997年06期

3 李志春,吳逸明,徐玉寶,陳琛;煤焦瀝青煙提取物致大鼠肺泡巨噬細(xì)胞DNA損傷作用[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2001年04期

4 謝俊剛,徐永健,張珍祥,張寧,倪望,陳仕新;DNA損傷與慢性阻塞性肺疾病的關(guān)系[J];中華內(nèi)科雜志;2005年09期

5 賀錫雯;生物體姊妹染色單體互換:一種檢測DNA損傷的靈敏方法[J];國外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊);1979年06期

6 王民生,蔣蕓,陳炎磐;異佛爾酮二異氰酸酯誘發(fā)DNA損傷的研究[J];衛(wèi)生毒理學(xué)雜志;1990年03期

7 孟建峰,莊志雄,倪祖堯;單細(xì)胞凝膠電泳法測定鎳化物對人血細(xì)胞的DNA損傷[J];中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志;1997年06期

8 劉玉梅;張潤玲;蘇海翔;;新生兒缺氧缺血性腦病血谷胱甘肽過氧化物酶水平與DNA損傷的關(guān)系探討[J];國外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊;2005年12期

9 所起鳳;杜文婷;楊鳴鳴;范雪嬌;劉戟;;過氧化氫誘導(dǎo)的人正常和早老細(xì)胞中DNA損傷及其修復(fù)研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2011年05期

10 李新蘭;DNA損傷將增加黑色素的生成[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1996年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 朱宏翔;胡建安;武越;黃云;熊敏如;;人支氣管上皮細(xì)胞5-脂氧合酶介導(dǎo)的4-氨基聯(lián)苯活化及DNA損傷[A];湖南省預(yù)防醫(yī)學(xué)會勞動衛(wèi)生專業(yè)委員會2009年學(xué)術(shù)交流會議論文集[C];2009年

2 朱萍萍;廖惠珍;張金華;施文振;;不同食物對鎘致小鼠肝細(xì)胞DNA損傷的影響[A];中國毒理學(xué)會第四屆全國學(xué)術(shù)會議論文（摘要）集[C];2005年

3 潘虹;陳鳳秀;任思沖;王若菡;劉戟;;活性氧自由基導(dǎo)致的人類正常細(xì)胞和早老細(xì)胞中DNA損傷及其修復(fù)效率的比較(英文)[A];第九屆西南三省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2008年

4 吳志鴻;;彗法分析紫外線誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞DNA的損傷及抗氯化劑對DNA損傷的拮抗作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二屆全國眼科學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2007年

5 張志超;王媛媛;吳桂葉;錢旭紅;;染色質(zhì)構(gòu)像變化引起轉(zhuǎn)錄阻滯觸發(fā)p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡:利用一對DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)探針研究DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[A];中國化學(xué)會第26屆學(xué)術(shù)年會化學(xué)生物分會場論文集[C];2008年

6 羅瓊;黃荷鳳;錢羽力;朱小明;孟慶霞;;環(huán)境電磁輻射對小鼠種植前胚胎DNA損傷及其機制的研究[A];首屆滬浙婦產(chǎn)科學(xué)術(shù)論壇暨2006年浙江省婦產(chǎn)科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2006年

7 曹毅;陳瑞;王仲文;邢曉紅;王小莉;;輻射和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的DNA損傷研究[A];中華醫(yī)學(xué)會放射醫(yī)學(xué)與防護學(xué)分會第三次全國中青年學(xué)術(shù)交流會論文匯編[C];2001年

8 梁建成;汪春紅;;維生素C抗DNA損傷作用的研究進展[A];湖北省、武漢市營養(yǎng)學(xué)會第十屆學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

9 何蕊;江其生;;單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)及其在核輻射等因素誘導(dǎo)的DNA損傷評估中的應(yīng)用[A];第十屆全軍檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 李雪竹;嚴(yán)海東;王俊;劉娜;;糖基化終產(chǎn)物對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞DNA損傷影響的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會腎臟病學(xué)分會2006年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2006年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 黑龍江哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心 劉曉波 李晶 樸海錦 程玉芝 李巖 薛長玲 李桂玉;核酸對鉛中毒大鼠DNA損傷的影響[N];保健時報;2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 劉偉;硫丹對生物DNA損傷和土壤微生物群落多樣性的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 劉婷婷;亞硝基脲導(dǎo)致DNA損傷機理的密度泛函理論研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2013年

3 劉金鳳;PML NBs新組分分子鑒定及其在DNA損傷反應(yīng)中的功能機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

4 吳涵;透明質(zhì)酸對滴眼液常用促滲劑誘導(dǎo)角膜上皮細(xì)胞DNA損傷保護作用的研究[D];浙江大學(xué);2011年

5 潘欣;SOX4參與了DNA損傷反應(yīng)中p53的激活[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2008年

6 王浩彤;EGFR突變非小細(xì)胞肺癌對化療藥物引發(fā)DNA損傷敏感性篩查及臨床意義[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2014年

7 武冬梅;二氧化硫?qū)π∈蟛煌M織器官的氧化應(yīng)激、DNA損傷及細(xì)胞因子的影響[D];山西大學(xué);2004年

8 茹晉麗;甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺對大鼠毒副作用和細(xì)胞周期、DNA損傷作用機制的實驗研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

9 張廣林;順鉑誘導(dǎo)DNA損傷的核蛋白組學(xué)研究和microRNA分析[D];浙江大學(xué);2011年

10 邢德印;DNA損傷和DNA修復(fù)基因多態(tài)與食管癌風(fēng)險[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 朱越;FOXO3a信號在納米二氧化鈦氣管暴露致大鼠DNA損傷中的作用研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 章艷燕;五味子乙素預(yù)防BaP致HTR-8/SV neo細(xì)胞氧化損傷及DNA損傷的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 董建云;DEB通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞DNA損傷和周阻滯的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

4 陳文濤;泛素連接酶Ring2在苯并(a)芘致人支氣管上皮細(xì)胞DNA損傷及細(xì)胞周期變化中的作用研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

5 李艷強;甲基叔丁基醚單一及與鎘復(fù)合對蚯蚓生理指標(biāo)和DNA損傷影響研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 許時麗;依達拉奉對COPD患者外周血單個核細(xì)胞的DNA損傷和NF-κB水平影響的研究[D];南華大學(xué);2015年

7 駱慧惠;4E-BP1在電離輻射誘發(fā)DNA損傷應(yīng)激中的作用及其分子機制研究[D];南華大學(xué);2015年

8 邱巖巖;DNA電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建及評價雙酚A、丙烯酰胺對DNA損傷的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

9 廖天錄;DNA多層膜的自組裝構(gòu)建及在DNA損傷中的初步研究[D];西北師范大學(xué);2008年

10 王媛媛;利用DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)探針研究DNA損傷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[D];大連理工大學(xué);2008年

，

本文編號：2345747