【摘要】：急性放射損傷的防治一直是各國重點(diǎn)開展研究的領(lǐng)域。目前造血干細(xì)胞移植和造血生長因子的應(yīng)用仍是治療極重度骨髓型急性放射病的主要措施，但作用有限。因此，急需尋找新的預(yù)防或治療方法。硫氧還蛋白（TRX）具有清除自由基、抑制凋亡和促細(xì)胞生長等多重生物學(xué)作用，而間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）易于外源基因轉(zhuǎn)染和表達(dá)，且具有向照射后受損組織聚集的生物學(xué)特性。為此我們觀察了腺病毒介導(dǎo)hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSC）在急性放射損傷的NOD/SCID小鼠中的修復(fù)作用。為基因修飾的MSC治療急性輻射相關(guān)性損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。經(jīng)過相關(guān)文獻(xiàn)的檢索，目前尚未見國內(nèi)外有相關(guān)研究的報(bào)道。 第一，我們采用骨片消化結(jié)合細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)小鼠骨實(shí)質(zhì)MSC；采用膠原酶消化法培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（hucMSC），顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及細(xì)胞表型，采用油紅染色鑒定成脂誘導(dǎo)情況；阿爾辛藍(lán)及甲苯胺藍(lán)染色檢測成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)情況；堿性磷酸酶染色及VonKossa染色檢測成骨細(xì)胞誘導(dǎo)情況。結(jié)果表明，分離、擴(kuò)增培養(yǎng)的MSC細(xì)胞形態(tài)均一，其中小鼠骨實(shí)質(zhì)MSC高表達(dá)Sca-1、CD29和CD44，而不表達(dá)CD11b、CD117、CD34和CD45；hucMSC細(xì)胞高表達(dá)HLA-I、CD105、CD166、CD73及CD90，不表達(dá)CD31、CD14、CD34、CD45、CD80、CD86及HLA-DR，符合MSC的表型特點(diǎn)。細(xì)胞周期檢測顯示，90%以上的細(xì)胞處于G0/G1期。在特定誘導(dǎo)條件下，兩種MSC細(xì)胞均可向成骨、成軟骨及脂肪細(xì)胞分化。 第二，我們以hTRX為目的基因，設(shè)計(jì)含有Not I和EcoR V酶切位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增hTRX基因全長序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的pDC316-mCMV穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP，同時(shí)選用不含目的基因的空腺病毒質(zhì)粒pAd316-EGFP作為對照。利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHG lox_E1，3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-hTRX-EGFP共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，得到腺病毒重組質(zhì)粒pAd-hTRX-EGFP，并在其中包裝擴(kuò)增病毒，將獲得的病毒用氯化銫高速梯度離心、純化病毒，測定病毒顆粒數(shù)及滴度。采用PCR方法對重組腺病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PCR和Not I、EcoR V酶切鑒定，證實(shí)含有hTRX基因，測序結(jié)果和TRX的理論序列一致。成功制備了純度較高的病毒液，其中Ad-hTRX-EGFP病毒滴度達(dá)5.558×10~(10)pfu/ml，對照病毒Ad-EGFP病毒滴度達(dá)3.1×10~(10)pfu/ml。 第三，根據(jù)不同梯度的感染復(fù)數(shù)（MOI），我們檢測了重組腺病毒載體Ad-EGFP對小鼠骨實(shí)質(zhì)MSC的感染效率以及重組腺病毒載體Ad-hTRX-EGFP對293細(xì)胞和hucMSC的感染效率，用RealTime PCR檢測了細(xì)胞內(nèi)hTRX基因mRNA表達(dá)，采用Western blot檢測了細(xì)胞內(nèi)hTRX蛋白的表達(dá)。并探討了感染hTRX基因?qū)ucMSC細(xì)胞周期及分化特性的影響。結(jié)果顯示，隨著MOI值的升高，感染效率逐漸提高，當(dāng)MOI=250時(shí)，Ad-EGFP對小鼠MSC的感染效率為46.78%；而當(dāng)MOI=100時(shí)，Ad-hTRX-EGFP對293細(xì)胞和hucMSC的感染效率分別為92.5%和95.22%。Westernblot檢測顯示，感染后的293細(xì)胞和hucMSC細(xì)胞內(nèi)hTRX蛋白量增高，hucMSC細(xì)胞內(nèi)hTRX基因mRNA水平升高了10.52±3.21倍（P0.05）。病毒感染后的hucMSC細(xì)胞周期顯示，93.2%的細(xì)胞處于G0/G1期。在特定誘導(dǎo)條件下，感染后的hucMSC細(xì)胞可向軟骨及脂肪細(xì)胞分化。說明感染hTRX對hucMSC的細(xì)胞周期及分化沒有影響。 最后，我們評價(jià)了hTRX修飾的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在NOD/SCID小鼠急性放射損傷中的修復(fù)作用。將hTRX修飾的hucMSC通過尾靜脈輸注給經(jīng)4.5Gy全身照射的NOD/SCID小鼠體內(nèi)，并設(shè)置hucMSC治療組和單純照射組。通過觀察小鼠一般狀況和生存時(shí)間，檢測血常規(guī)、骨髓Lin~-CD117~+細(xì)胞比例和組織病理來評價(jià)治療效果。結(jié)果顯示，照射后第7天、第11天、第20天及第30天hTRX-hucMSC組小鼠的紅細(xì)胞及血紅蛋白顯著高于單純照射組和hucMSC組小鼠，其中第11天及第30天，hTRX-hucMSC組與其他兩組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；而第7天及第20天僅hTRX-hucMSC組與單純照射組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。雖然第7天、第20天及第30天hucMSC組小鼠的紅細(xì)胞及血紅蛋白也高于單純照射組，但二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。+30天hTRX-hucMSC組小鼠骨髓Lin-CD117+細(xì)胞比例明顯高于其他兩組，且均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。各組小鼠照射30天組織病理顯示，肝、脾和腸病理改變相對較輕微，而骨髓及肺臟病理改變顯著。單純照射組肝細(xì)胞輕度水腫，肝動(dòng)脈及門靜脈充血，可見膽栓形成；脾臟可見血管充血及大量炎細(xì)胞浸潤。hucMSC組和hTRX-hucMSC組肝脾病理表現(xiàn)較單純照射組略減輕。腸粘膜病理各組無明顯差異。單純照射組小鼠肺泡壁顯著增寬，血管顯著充血，出血，間質(zhì)水腫，透明膜形成，炎細(xì)胞浸潤顯著。hucMSC組小鼠肺泡壁增寬，血管充血，中等量炎細(xì)胞浸潤。而hTRX-hucMSC組小鼠肺泡壁間隔正常，少許血管充血，少量炎細(xì)胞浸潤。提示hTRX-hucMSC組小鼠肺損傷比其他兩組小鼠明顯減輕。單純照射組小鼠骨髓組織增生極度減低；hucMSC組小鼠骨髓組織增生輕度減低；而hTRX-hucMSC組小鼠骨髓增生活躍。各組生存時(shí)間顯示，單純照射組小鼠生存時(shí)間為26±14.43d；hucMSC組為29.33±14.49d，生存時(shí)間較空白組延長，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.36），而hTRX-hucMSC組小鼠為56.67±5.25d。生存時(shí)間較前兩組顯著延長（P0.01）。以上結(jié)果說明，hTRX通過保護(hù)了殘存的造血干細(xì)胞，特別是促進(jìn)紅細(xì)胞及血紅蛋白生成，來保證重要組織臟器的氧供應(yīng)。此外，通過清除自由基及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷。因此能夠延長小鼠生存時(shí)間。 以上研究結(jié)果表明，腺病毒能夠高效的感染hucMSC；腺病毒介導(dǎo)hTRX基因能在hucMSC中高表達(dá)；hTRX基因修飾的hucMSC能夠減輕急性放射損傷引起的組織損傷，對急性放射損傷的治療具有較好的效果。本研究將基因治療與細(xì)胞治療相結(jié)合，，為治療急性放射損傷提供了新的可能手段。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R818

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本文編號：2318882