本文選題：SOD1 + 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控　； 參考：《蘇州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的：目前克服腫瘤細(xì)胞放射抗拒性策略較多,但效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn)SOD1高表達(dá)是腫瘤對(duì)放化療抵抗的重要機(jī)制之一，但SOD1高表達(dá)的機(jī)制不明。基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控多與3’UTR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)，但關(guān)于腫瘤SOD1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控報(bào)道較少，因此本課題擬探討腫瘤SOD1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制及其對(duì)腫瘤反射效應(yīng)的影響，為以SOD1為靶標(biāo)的放療增敏策略提供理論基礎(chǔ)。 方法：本課題主要以卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和胰腺癌PANC1為模型，，（1）構(gòu)建SOD-3’UTR的熒光素酶報(bào)告載體，觀察SOD1、SOD2-3’UTR在腫瘤細(xì)胞對(duì)熒光素酶活性的影響，以及在過氧化氫和X射線作用下的變化；并應(yīng)用RT-PCR和蛋白印跡法驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞在過氧化氫作用下SOD1mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化（2）比較SOD1-3’UTR在兩種腫瘤細(xì)胞中對(duì)熒光素酶活性的影響，并應(yīng)用RT-PCR法檢測螢火素酶mRNA的水平；并進(jìn)一步應(yīng)用蛋白印跡法觀察外源SOD-3’UTR對(duì)內(nèi)源性SOD蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建不同的SOD1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體，包括含有不同AREs的、miRNA（miR-224、-377、-621）結(jié)合位點(diǎn)缺失的、單個(gè)或多個(gè)AREs聯(lián)合缺失的3’UTR載體，或應(yīng)用miRNA的擬似物或抑制劑等觀察RNA元件對(duì)3-‘UTR所介導(dǎo)的熒光素酶性的影響，或SOD1蛋白表達(dá)的變化。構(gòu)建SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體，進(jìn)一步對(duì)該載體進(jìn)行AREs缺失突變，檢測X射線處理后熒光素酶活性的變化。（3）RNA干擾技術(shù)下調(diào)AUF1或外源真核表達(dá)上調(diào)AUF1，觀察其對(duì)SOD1蛋白表達(dá)的變化；以及SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的變化；并觀察AUF1下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞ROS水平的影響；進(jìn)一步應(yīng)用RNA免疫共沉淀檢測AUF1與SOD1-3’UTR的直接作用；免疫組化法檢測胰腺癌標(biāo)本中AUF1和SOD1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：（1）SOD1、SOD2-3’UTR正義載體與反義載體相比，熒光素酶活性增加近20倍；過氧化氫100μM明顯增加了A2780細(xì)胞內(nèi)SOD1、SOD2-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性；10Gy射線明顯增加了A2780細(xì)胞內(nèi)SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;過氧化氫100μM增加了A2780細(xì)胞SOD1mRNA和蛋白表達(dá)水平；（2）在A2780和PANC1細(xì)胞內(nèi)SOD1-3’UTR正義載體相比反義、空載體的熒光素酶活性明顯增加；SOD1-3’UTR增加了A2780細(xì)胞螢火素酶mRNA的水平；外源SOD-3’UTR降低了A2780細(xì)胞內(nèi)源性SOD蛋白的表達(dá)，并且外源SOD1-3’UTR能降低內(nèi)源性SOD2蛋白的表達(dá)；逐步的對(duì)SOD1-3’UTR作片段的截?cái)嗪蠼Y(jié)果顯示熒光素酶活性也逐漸降低；miR-224, miR-377結(jié)合位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致熒光素酶活性顯著下降，而miR-621結(jié)合位點(diǎn)的缺失未見明顯變化；miR-377或miR-621的擬似物或抑制劑并沒有顯著影響內(nèi)源性SOD1的表達(dá)，也沒有影響SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性；任一個(gè)ARE的缺失均能降低熒光素酶活性，以ARE6的作用最強(qiáng)；但當(dāng)載體僅包含2個(gè)或4個(gè)ARE本身的序列時(shí)熒光素酶活性幾乎測不出。ARE6的缺失逆轉(zhuǎn)了X射線誘導(dǎo)的SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的增加。（3）AUF1的下調(diào)明顯降低了SOD1蛋白的表達(dá)水平，而HuR的下調(diào)對(duì)SOD1蛋白表達(dá)的影響不大，并與熒光素酶活性的結(jié)果一致；AUF1的高表達(dá)增加了這兩種細(xì)胞系內(nèi)的SOD1-3’UTR介導(dǎo)的熒光素酶活性；RT-PCR法僅能從AUF1沉淀物中檢測到SOD1-3’UTR的表達(dá)；93例胰腺癌組織標(biāo)本檢測的結(jié)果顯示AUF1和SOD1的蛋白表達(dá)明顯相關(guān)。 結(jié)論：（1）SOD1-3’UTR與腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下SOD1的表達(dá)相關(guān)（2）SOD1-3’UTR能增加腫瘤細(xì)胞SOD1mRNA的穩(wěn)定性，并與ARE特別是ARE6相關(guān)，與所檢測的miRNA結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的可能性不大。（3）AUF1通過與SOD1-3’UTR結(jié)合影響腫瘤SOD1表達(dá)是SOD1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制之一，并能影響腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)的和放射誘導(dǎo)的ROS水平。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R730.55

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本文編號(hào)：1738352