本文關(guān)鍵詞： PET 人工韌帶 羥丙基纖維素 前交叉韌帶重建 移植物-骨愈合 前交叉韌帶 人工韌帶 聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯 羥丙基纖維素 親水性 腱(移植物)-骨愈合 PET 羥丙基纖維素 細(xì)胞相容性 成骨分化 PET 羥丙基纖維素 移植物-骨愈　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶(anterior cruciate ligament, ACL)損傷是臨床常見的嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)損傷。ACL具有限制脛骨向前過度移動(dòng)的重要功能,其損傷后可發(fā)生膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定,從而可造成患者運(yùn)動(dòng)能力顯著下降,影響其日常生活,并可繼發(fā)軟骨損傷和骨關(guān)節(jié)炎。美國(guó)每年有40萬(wàn)ACL損傷病例,相關(guān)治療費(fèi)用達(dá)70億美元。我國(guó)運(yùn)動(dòng)員ACL損傷的患病率為0.5%-10.5%,隨著全民健身運(yùn)動(dòng)和競(jìng)技體育的發(fā)展,ACL損傷的發(fā)病率逐年呈明顯上升趨勢(shì)。ACL重建移植物包括自體、異體韌帶或肌腱和人工韌帶。自體移植物最常用,但存在供區(qū)病損和ACL重建翻修術(shù)移植物來(lái)源缺乏等問題。異體移植物無(wú)供區(qū)病變,但其愈合時(shí)間長(zhǎng),力學(xué)強(qiáng)度僅為自體的70%,一年內(nèi)的失敗率可達(dá)13%,并可能傳播疾病和引起免疫排斥。由于自體和異體移植物重建ACL都存在一些弊端,尋找更理想的韌帶移植物,一直是骨科和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。理想的人工韌帶應(yīng)滿足以下要求：良好的生物相容性,能促進(jìn)自體組織愈合與再生；仿生學(xué)設(shè)計(jì),力學(xué)性能優(yōu)良,術(shù)后患者可以早期恢復(fù)運(yùn)動(dòng)。目前臨床應(yīng)用比較廣泛的人工韌帶只有法國(guó)研制的LARS人工韌帶,它采用已用于臨床手術(shù)縫線和人造血管的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)材料。2010年,我科研究報(bào)道了LARS人工韌帶植入術(shù)后3-5年的多中心研究,結(jié)果顯示93%以上的患者療效滿意,功能恢復(fù)：另外,仍有5.7%的失敗率,其中包括擠壓螺釘松動(dòng)、移植物-骨愈合不佳、滑膜炎等。因此,如何提高PET韌帶與骨隧道的愈合能力,誘導(dǎo)自體骨組織長(zhǎng)入,使PET韌帶與骨組織形成穩(wěn)定的接合,并大幅度提高PET重建ACL手術(shù)的成功率和術(shù)后療效,成為我們的研究目的。羥丙基纖維素(Hydroxypropylcellulose, HPC)是一種以天然纖維素為原料經(jīng)化學(xué)改性制得的半合成型高分子聚合物,屬于非離子型纖維素醚。HPC無(wú)臭、無(wú)味、無(wú)毒,呈白色粉末狀,溶于水,對(duì)光熱均穩(wěn)定。因HPC與許多陰離子、陽(yáng)離子、非離子及其兩性表面活性劑具有良好的相容性,與其他聚合物具有良好的溶解性、生物相容性和生物降解性,被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、石油化工等領(lǐng)域。本課題用HPC涂層處理PET人工韌帶,以期處理過的PET人工韌帶能夠有更好的生物相容性,能夠促進(jìn)PET韌帶與骨的愈合,從而提高PET人工韌帶移植的成功率。我們?cè)赪istar大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)、ACL成纖維細(xì)胞及滑膜細(xì)胞RSC-364中驗(yàn)證HPC涂層對(duì)細(xì)胞相容性及成骨分化的影響。隨后在新西蘭大白兔關(guān)節(jié)外腱-骨愈合模型初步驗(yàn)證HPC涂層處理的PET移植物可否促進(jìn)移植物-骨愈合。此外,為了利用比格犬關(guān)節(jié)內(nèi)ACL重建模型來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證HPC涂層的作用,本課題成功制備了適合比格犬ACL重建的PET人工韌帶,且其生物力學(xué)性能良好,基本適合用于比格犬的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。最后為了克服目前LARS人工韌帶的缺點(diǎn),打破其在國(guó)內(nèi)的壟斷并降低人工韌帶的成本,我們對(duì)人工韌帶進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)改造,旨在設(shè)計(jì)處新型國(guó)產(chǎn)化的懸吊式人工韌帶。為進(jìn)一步研究腱(移植物)-骨愈合奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分羥丙基纖維素涂層-PET復(fù)合材料對(duì)體外細(xì)胞相容性及成骨分化影響的實(shí)驗(yàn)摘要目的：在體外觀察并比較羥丙基纖維素(Hydroxypropylcellulose, HPC)-PET復(fù)合材料(HPC/PET組)與未經(jīng)處理的PET材料(PET組)對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、前交叉韌帶(ACL)成纖維細(xì)胞及RSC-364滑膜細(xì)胞相容性及成骨分化的影響。方法：將HPC-PET復(fù)合材料及PET纖維置于24孔培養(yǎng)板中,分別都加入BMSCs、ACL成纖維細(xì)胞及RSC-364細(xì)胞懸液(密度2×104/m1)。通過CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)法于細(xì)胞培養(yǎng)第1d、2d、4d、6d、8d和10d時(shí),檢測(cè)HPC涂層對(duì)BMSCs細(xì)胞、ACL成纖維細(xì)胞及RSC-364細(xì)胞增殖活性的影響。Western blotting法于細(xì)胞培養(yǎng)第7天時(shí)檢測(cè)BMSCs細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及RSC-364細(xì)胞中Integrin-β1的蛋白含量,以此觀察HPC涂層對(duì)細(xì)胞粘附性的影響。培養(yǎng)7天后對(duì)BMSCs、ACL成纖維細(xì)胞及RSC-364細(xì)胞行掃描電鏡(SEM),以觀察HPC/PET組與PET組中細(xì)胞形態(tài)的變化。ELISA法于培養(yǎng)第5d、7d、10d、14d時(shí)檢測(cè)BMSCs細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)活性和Osteopontin的蛋白表達(dá)量,以及Western blotting法于培養(yǎng)第7d時(shí)檢測(cè)BMSCs細(xì)胞中BMP-2和BMP-7的蛋白含量,以此觀察HPC涂層對(duì)BMSCs細(xì)胞的成骨分化能力。結(jié)果：SEM分析顯示經(jīng)HPC涂層修飾后,PET纖維表面覆蓋了一薄層涂層。傅立葉紅外光譜分析顯示相比于單純PET材料,HPC/PET材料在3600-3200cm-1處出現(xiàn)了HPC羥基的伸縮振動(dòng)及3011-2819cm-1處出現(xiàn)HPC中的C-H伸縮振動(dòng)。CCK-8法檢測(cè)BMSCs細(xì)胞的增殖活性發(fā)現(xiàn),HPC/PET組的細(xì)胞增殖在培養(yǎng)6天,8天及10天時(shí)的吸光度A450nm值均高于PET組(P值均0.05)。CCK-8法檢測(cè)ACL成纖維細(xì)胞的增殖活性結(jié)果顯示,HPC/PET組的細(xì)胞增殖在培養(yǎng)4天時(shí),6天,8天,10天時(shí)的吸光度A450 nm值高于PET組(P值均0.05)。CCK-8法檢測(cè)RSC-364細(xì)胞的增殖活性發(fā)現(xiàn),HPC/PET組的細(xì)胞增殖在培養(yǎng)8天、10天時(shí)的吸光度A450 nm值均高于PET組(P值均0.05)。SEM觀察發(fā)現(xiàn)PET組中無(wú)BMSCs、成纖維細(xì)胞和RSC-364細(xì)胞在PET纖維表面的粘附,而HPC/PET組中的3種細(xì)胞的粘附伸展均良好,細(xì)胞立體感較強(qiáng),表現(xiàn)出一個(gè)多邊形的形態(tài),且細(xì)胞間的突觸聯(lián)系較多。Western blotting分析結(jié)果顯示：培養(yǎng)7天時(shí)3種細(xì)胞中Integrin-β1在HPC/PET組中的表達(dá)量顯著高于在PET組中的表達(dá)(P值均0.01)。ELISA法檢測(cè)顯示,BMSCs培養(yǎng)5天,7天時(shí),10天和14天時(shí)ALP的活性在HPC/PET組高于在PET組中(P值均0.05)。BMSCs培養(yǎng)7天,10天和14天時(shí)HPC/PET組中Osteopontin的表達(dá)量高于在PET組(P值均0.05)。而培養(yǎng)7天時(shí)BMSCs細(xì)胞中BMP-2和BMP-7在HPC/PET組中的表達(dá)量均顯著高于在PET組中的表達(dá)(P值均0.01)。結(jié)論：HPC-PET復(fù)合材料未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的毒性,且還能明顯提高體外BMSCs、成纖維細(xì)胞及RSC-364滑膜細(xì)胞的細(xì)胞相容性及成骨分化能力。HPC涂層對(duì)BMSCs細(xì)胞的成骨分化能力。第二部分羥丙基纖維素涂層對(duì)PET移植物在兔關(guān)節(jié)外模型中與骨愈合影響的實(shí)驗(yàn)摘要目的：探討羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose, HPC)涂層是否能加強(qiáng)PET人工韌帶移植物與骨道愈合。方法：本研究采用30只新西蘭大白兔,采用關(guān)節(jié)外腱-骨愈合模型將人工韌帶植入脛骨近端。一側(cè)肢體以植入HPC涂層韌帶為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)側(cè)肢體植入非HPC涂層韌帶為空白組。兔子在4周及8周處死,分別進(jìn)行生物力學(xué),組織學(xué)和real time-PCR基因測(cè)試。結(jié)果：術(shù)后4周和8周時(shí),生物力學(xué)測(cè)試所有組織標(biāo)本均可被完全拉出骨隧道,無(wú)韌帶斷裂發(fā)生。術(shù)后4周時(shí)HPC涂層組與對(duì)照組之間的最大拉力統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P=0.328)。術(shù)后8周時(shí)HPC涂層組的最大拉力明顯高于對(duì)照組(P0.001)。同樣,術(shù)后4周時(shí)HPC涂層組與對(duì)照組之間的剛度結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著性差異(P=0.128)。術(shù)后8周時(shí),HPC涂層組的剛度高于對(duì)照組(P=0.018)。術(shù)后4周時(shí)較厚的纖維樣組織出現(xiàn)在對(duì)照組及HPC涂層組的移植物-骨界面。術(shù)后4周時(shí)在HPC涂層組中發(fā)現(xiàn)一些纖維組織穿插進(jìn)入人工韌帶。術(shù)后8周時(shí),HPC涂層組中發(fā)現(xiàn)移植物-骨界面上有大量突出的新骨形成；此外,移植物-骨界面相對(duì)較窄,疤痕組織較少,部分界面組織長(zhǎng)入PET移植物內(nèi),并與移植物PET纖維相交織。而對(duì)照組中僅見較厚的纖維疤痕組織存在于移植物-骨界面中,無(wú)新骨形成。組織形態(tài)學(xué)分析顯示,術(shù)后8周時(shí)HPC涂層組的界面寬度顯著狹窄于對(duì)照組(P0.001)。術(shù)后4周時(shí),HPC涂層組中BMP-2和Osteopontin的mRNA表達(dá)水平高于它們?cè)趯?duì)照組中的表達(dá)水平(P值均0.05)。術(shù)后8周時(shí),BMP-2在HPC涂層組中的mRNA表達(dá)水平高于它在對(duì)照組中的表達(dá)水平(P=0.010)。結(jié)論：本研究表明人工韌帶表面HPC涂層能夠有效地促進(jìn)人工韌帶骨隧道內(nèi)移植物與骨愈合。層韌帶為空白組。兔子在4周及8周處死,分別進(jìn)行生物力學(xué),組織學(xué)和real time-PCR基因測(cè)試。第三部分比格犬尺寸的PET人工韌帶的制備及生物力學(xué)性能檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)摘要目的：制備出一種比格犬尺寸的PET人工韌帶用以比格犬ACL重建,并對(duì)其進(jìn)行生物力學(xué)的測(cè)試。方法：對(duì)LARS人工韌帶的結(jié)構(gòu)及組織進(jìn)行分析,利用企業(yè)現(xiàn)有設(shè)備,進(jìn)行了工藝調(diào)整,試織了一種織物結(jié)構(gòu)。對(duì)在不同工藝條件下織造的基布進(jìn)行了拉伸性能測(cè)試。采用不同的清洗方案對(duì)PET人工韌帶織物試樣進(jìn)行清洗,同時(shí)設(shè)定空白組。觀察各組中細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。對(duì)人工韌帶半成品進(jìn)行縫制,并最終縫合處比格犬尺寸的PET人工韌帶成品。檢測(cè)比格犬尺寸的PET人工韌帶的力學(xué)性能,包括拉伸強(qiáng)力測(cè)試、靜態(tài)蠕變測(cè)試(疲勞性能測(cè)試)及空隙率測(cè)試等。結(jié)果：試織的織物縱密為17圈/cm時(shí),其斷裂強(qiáng)力、理論強(qiáng)力、強(qiáng)力損失率最高,而其斷裂伸長(zhǎng)率最低。各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況均較為良好,其中3#清洗方法細(xì)胞生長(zhǎng)最佳(P0.01)。比格犬尺寸PET人工韌帶拉伸強(qiáng)力為2959.53±7.25N,最大伸長(zhǎng)量為12.43±0.95mm,最大伸長(zhǎng)率為13.8±1.06%。比格犬尺寸PET人工韌帶體的靜態(tài)蠕變?yōu)榛謴?fù)24小時(shí)后最終伸長(zhǎng)率為0.16%,而LARS人工韌帶的恢復(fù)24小時(shí)后最終伸長(zhǎng)率1.5%。清洗前后比格犬尺寸PET人工韌帶織物的孔隙率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.880)。結(jié)論：成功制備了適合比格犬ACL重建的PET人工韌帶,且其生物力學(xué)性能良好,基本適合用于比格犬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。比格犬尺寸的PET人工韌帶成品。檢測(cè)比格犬尺寸的PET人工韌帶的力學(xué)性能,包括拉伸強(qiáng)力測(cè)試、靜態(tài)蠕變測(cè)試(疲勞性能測(cè)試)及空隙率測(cè)試等。第四部分羥丙基纖維素涂層-PET人工韌帶用于比格犬前交叉韌帶重建的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的：探討羥丙基纖維素(hydroxypropylcellulose, HPC)涂層的PET人工韌帶重建比格犬ACL是否能加強(qiáng)PET人工韌帶移植物與骨道的愈合。方法：本研究選取24只成年雄性比格犬,使用HPC涂層的PET人工韌帶(HPC組)和無(wú)HPC涂層的PET人工韌帶(對(duì)照組)植入比格犬左側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)進(jìn)行ACL重建。術(shù)后4周及16周處死動(dòng)物,獲得股骨-PET人工韌帶移植物-脛骨復(fù)合物。對(duì)此復(fù)合物進(jìn)行生物力學(xué),組織學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)。結(jié)果：術(shù)后4周和16周時(shí),所有PET人工韌帶均可被完全拉出骨隧道,無(wú)PET人工韌帶斷裂發(fā)生。術(shù)后4周時(shí)HPC涂層組中骨隧道內(nèi)人工韌帶-骨的最大拉力高于對(duì)照組(P=0.010)；而術(shù)后16周時(shí)HPC涂層組的最大拉力顯著高于對(duì)照組(P=0.001)。術(shù)后16周時(shí)HPC涂層組的剛度高于對(duì)照組(P=0.020)。術(shù)后4周時(shí),在對(duì)照組中僅發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維形成,而HPC涂層組中發(fā)現(xiàn)較多膠原纖維形成并長(zhǎng)入移植物內(nèi)。術(shù)后16周時(shí)對(duì)照組中僅見膠原纖維形成數(shù)量有所增加,無(wú)新骨形成,而HPC涂層組中發(fā)現(xiàn)移植物-骨界面上有突出的新骨形成,并包繞移植物PET纖維。術(shù)后4周時(shí)BMP-7和TGF-β1在HPC涂層組中的mRNA表達(dá)水平顯著高于它們?cè)趯?duì)照組中的表達(dá)水平(P值均0.01)；COL3和VEGF在HPC涂層組中的mRNA表達(dá)水平高于在對(duì)照組中的表達(dá)水平(P值均0.05)。術(shù)后16周時(shí)COL3、Osteocalcin和RUNX2在HPC涂層組中的mRNA表達(dá)水平高于在對(duì)照組中的表達(dá)水平(P值均0.05)。術(shù)后4周時(shí),HPC涂層-PET人工韌帶組內(nèi)有薄層滑膜組織覆蓋于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的人工韌帶自由纖維部,而對(duì)照組內(nèi)可見較為明顯的軟組織覆蓋于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的人工韌帶自由纖維部。術(shù)后4個(gè)月時(shí),HPC涂層-PET人工韌帶組內(nèi)有厚層滑膜組織覆蓋于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的人工韌帶自由纖維部,而在對(duì)照組內(nèi)仍僅有少量滑膜組織覆蓋于關(guān)節(jié)腔內(nèi)的人工韌帶自由纖維部。免疫組化檢測(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)人工韌帶自由纖維部分中COL1的結(jié)果顯示,術(shù)后4周和16周時(shí),HPC組中COL1的表達(dá)量均顯著大于對(duì)照組(P值均0.01)。結(jié)論：本研究表明PET人工韌帶表面HPC涂層能夠有效地促進(jìn)PET人工韌帶與骨隧道的愈合。第五部分新型懸吊式人工韌帶的外觀及結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為了克服現(xiàn)有LARS人工韌帶固定方式所存在的缺陷,本研究已完成幾種新型懸吊式人工韌帶的設(shè)計(jì),并已獲得相關(guān)實(shí)用新型專利的授權(quán)。新型懸吊式人工韌帶的環(huán)袢可與紐扣鋼板(Endobutton)相連接,不僅實(shí)用方便、減少手術(shù)時(shí)間,提高了生物力學(xué)強(qiáng)度；最為重要的是避免了使用擠壓螺釘對(duì)骨道的擠壓及韌帶多孔表面結(jié)構(gòu)的擠壓,這樣更有利于韌帶結(jié)構(gòu)與骨隧道的緊密貼合,增加骨組織長(zhǎng)入韌帶多孔間隙的機(jī)會(huì),從而有利于骨組織長(zhǎng)入人工韌帶內(nèi),最終促進(jìn)移植物與骨的愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R873

【參考文獻(xiàn)】

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1 姬洪全,黨耕町,馬慶軍,王志國(guó);骨折愈合過程中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β_1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華外科雜志;1998年02期

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本文編號(hào)：1537442