本文關(guān)鍵詞： 放射 KGF-2突變體 放射性腸黏膜損傷 自噬 凋亡　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：基礎(chǔ)科學的進步推動應用科學的發(fā)展。在一百多年前,科學家倫琴發(fā)現(xiàn)X射線,目前無論軍事的核武器裝備,還是民用的核電站建設(shè)、以及臨床醫(yī)學開展的放射治療,都得到了長足發(fā)展。但隨之而來的放射性損傷也屢見不鮮,嚴重者除造血系統(tǒng)損傷外常伴有放射性腸黏膜損傷,目前臨床尚無療效明確的治療方法。國外已有研究表明角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)可以改善大劑量放化療后的黏膜炎,并已經(jīng)過美國FDA批準上市。作為同一生長因子家族的成員,角質(zhì)細胞生長因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)有望發(fā)揮類似的黏膜損傷治療作用。本研究團隊前期研制出與受體親和力更高、促細胞增殖活性更強的KGF-2突變體,并發(fā)現(xiàn)該突變體可顯著提高中低劑量γ射線照射后小鼠的存活率。在此基礎(chǔ)上,為深入解決放射性腸黏膜損傷的難題,我們開展了本研究,以期為戰(zhàn)時核輻射損傷救治及腫瘤患者放射性黏膜炎的治療提供新策略�！灸康摹垦芯拷琴|(zhì)細胞生長因子2(keratinocyte growth factor-2,KGF-2)突變體對放射性腸黏膜損傷的治療作用,并探討其分子機制�！緝�(nèi)容】分別在動物整體水平、組織學水平及細胞學水平開展研究,通過γ射線照射建模,研究KGF-2突變體發(fā)揮放射性腸黏膜損傷治療作用的最佳劑量、給藥時間及可能機理,并探討KGF-2突變體對細胞自噬和凋亡的影響�！痉椒敖Y(jié)果】將無特定病原體(specific pathogen free,SPF)C57BL/6J小鼠隨機分組,用γ射線放射源60 Co對小鼠進行單次全身照射,總劑量為12Gy。分別研究KGF-2突變體不同的給藥劑量、給藥時間以及不同數(shù)量的骨髓細胞移植對結(jié)果的影響。通過分析小鼠照射后30d存活率及平均體重變化,照射后72h小腸組織病理變化、凋亡與自噬情況,血炎性因子變化情況及血細胞分析,闡述KGF-2突變體對放射性腸黏膜損傷的治療效果。同時,我們利用人永生化角質(zhì)上皮細胞系為模型來研究KGF-2突變體發(fā)揮放射保護作用的分子機制。我們發(fā)現(xiàn),模型組小鼠在照射后10d內(nèi)全部死亡。在量效研究中,照射后30d,低劑量(6mg/kg)和高劑量(12mg/kg)KGF-2突變體給藥加骨髓移植組的生存率都優(yōu)于模型組;在時效研究中,KGF-2突變體(-2d給藥)加骨髓移植組的生存率優(yōu)于KGF-2突變體(-3d給藥)加骨髓移植組。在前述研究的基礎(chǔ)上,我們降低骨髓細胞移植數(shù)至2.0×106個/只,發(fā)現(xiàn)照射后30d,KGF-2突變體(6mg/kg,-2d給藥)加骨髓移植組小鼠生存率為100%,顯著高于對照組(0)和單純骨髓移植組(60%)。取照射后第7d平均體重變化分析,模型組為14.26±0.48g;單純KGF-2突變體給藥組為15.11±0.90g;KGF-2突變體給藥加骨髓移植組為16.24±0.98g;單純骨髓移植組為15.39±1.08g。在30d觀察期內(nèi),KGF-2突變體聯(lián)合骨髓移植組小鼠體重下降緩慢,回升早,且回升后體重穩(wěn)定。HE染色及免疫組織化學結(jié)果顯示,照射后模型組小鼠小腸損害明顯,小腸絨毛處細胞自噬及凋亡水平增高;KGF-2突變體給藥加骨髓移植組小鼠小腸組織各級結(jié)構(gòu)完整,免疫組化顯示小腸黏膜上皮細胞自噬增強,凋亡水平降低。與正常組相比,受照射小鼠的白細胞、紅細胞和血紅蛋白數(shù)都明顯降低。與模型組相比,予KGF-2突變體和/或骨髓移植治療后,KGF-2突變體(-2d給藥)加骨髓移植組小鼠的紅細胞和血紅蛋白的回升有統(tǒng)計學差異。ELISA檢測發(fā)現(xiàn),與模型組相比,KGF-2突變體給藥加骨髓移植組小鼠照射后血IL-6水平降低。為進一步明確KGF-2突變體發(fā)揮放射保護作用的分子機制,我們以Ha Ca T細胞系為實驗對象,發(fā)現(xiàn)經(jīng)γ射線照射后,細胞自噬相關(guān)蛋白LC3及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的表達均增高,且自噬發(fā)生的時間早于凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)KGF-2突變體能夠激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK等細胞內(nèi)重要的信號通路,推測KGF-2突變體對細胞自噬及凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用。隨后,我們利用細胞饑餓模型探討KGF-2突變體對細胞自噬及凋亡的影響。細胞經(jīng)長時間無血清培養(yǎng)后,再予KGF-2突變體刺激,用Western blot法檢測胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表達。發(fā)現(xiàn)經(jīng)無血清培養(yǎng)基長時間培養(yǎng)的細胞,凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達升高,說明長時間無血清培養(yǎng)可誘導細胞凋亡;予KGF-2突變體刺激后,Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達降低,說明KGF-2突變體可抑制細胞凋亡。用EBSS饑餓細胞,應用Western blot法檢測細胞自噬情況,發(fā)現(xiàn)LC3表達量增高;再予KGF-2突變體刺激,LC3蛋白表達下降;自噬抑制劑氯喹(CQ)使細胞LC3表達量增高,予KGF-2突變體刺激,LC3表達減少。將p EGFP-C3-MAP1LC3B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP-LC3顆粒大小及形態(tài),發(fā)現(xiàn)經(jīng)EBSS饑餓后細胞內(nèi)GFP-LC3顆粒增多,予KGF-2突變體刺激后GFP-LC3顆粒減少;CQ使胞內(nèi)GFP-LC3顆粒增多,予KGF-2突變體刺激后GFP-LC3顆粒減少。說明KGF-2突變體可以抑制饑餓誘導的自噬�！窘Y(jié)論】在動物水平我們證實,KGF-2突變體給藥聯(lián)合骨髓移植,可有效治療小鼠放射性腸黏膜損傷,明顯提高受照射小鼠的生存率,維持小鼠平均體重的穩(wěn)定,降低受照射小鼠的炎癥水平;在組織學水平我們發(fā)現(xiàn),KGF-2突變體給藥聯(lián)合骨髓移植可促進小鼠小腸黏膜修復,減少腸黏膜上皮細胞凋亡,促進其自噬;在細胞水平我們發(fā)現(xiàn),照射可使細胞發(fā)生自噬和凋亡,且自噬發(fā)生的時間早于凋亡,同時發(fā)現(xiàn)KGF-2突變體能激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK信號通路,抑制饑餓誘導的細胞自噬和凋亡,這為進一步明確KGF-2突變體對放射誘導的自噬和凋亡的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本課題證明,KGF-2突變體給藥聯(lián)合骨髓移植對放射性腸黏膜損傷具有明確的治療作用。在放射條件下,細胞自噬的發(fā)生早于凋亡,而KGF-2突變體可激活NF-κB、PI3K-AKT和MAPK-ERK信號通路,并抑制饑餓誘導的細胞自噬和凋亡。這提示我們,KGF-2突變體有可能通過干預細胞自噬過程而發(fā)揮抗凋亡的作用,其具體機制仍有待進一步研究。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.55
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本文編號：1518152