發(fā)布時間：2018-01-31 09:54

  本文關鍵詞： 輻射 NLRP3炎癥小體 細胞焦亡 骨髓巨噬細胞 免疫細胞損傷　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景放療作為重要的治療方法之一,主要用于多種惡性腫瘤細胞的殺傷。但其在發(fā)揮治療作用的同時也不可避免地殺傷一些正常細胞,成為限制其臨床應用的最重要原因。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),輻射除了殺傷分裂旺盛的細胞,還能導致多種免疫細胞顯著減少以及促炎因子釋放,從而影響受損細胞和組織的修復,抑制免疫甚至引發(fā)全身反應綜合征。巨噬細胞廣泛地分布于全身各種組織和器官中,在調(diào)節(jié)細胞功能,促進炎癥消退,修復損傷組織的過程中發(fā)揮重要作用。巨噬細胞作為固有免疫系統(tǒng)中響應輻射損傷最早的細胞類型,在輻射損傷的早期和晚期均觀察到巨噬細胞募集、活化、轉(zhuǎn)化并促進損傷組織修復的證據(jù)。巨噬細胞受損會嚴重阻礙機體暴露輻射后炎癥的消退和損傷組織的修復。研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎癥小體活化介導的細胞焦亡是巨噬細胞在病毒感染、熱應激損傷和鞭毛蛋白等多種刺激條件下的重要死亡方式。并且有研究發(fā)現(xiàn)輻射可以誘導肺組織和口腔黏膜等多種組織NLRP3炎癥小體活化從而介導細胞和組織損傷。因此,探索NLRP3炎癥小體活化介導的細胞焦亡在輻射誘導的巨噬細胞死亡中的作用可能為減輕放療毒副作用,提高治療效果提供新的策略。研究目的本課題組擬在體內(nèi)和體外水平研究輻射對巨噬細胞NLRP3炎癥小體和細胞焦亡的作用,并利用Nlrp3敲除小鼠闡明NLRP3炎癥小體在輻射誘導巨噬細胞焦亡中的作用機制。研究方法分離培養(yǎng)骨髓巨噬細胞,采用CCK-8試劑盒、焦亡檢測試劑盒、LDH活性檢測試劑盒和各種炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-18、IFN-γ、IL-1α、IL-6、MCP-1及IL-12p40)ELISA檢測試劑盒檢測輻射后巨噬細胞的存活情況、細胞焦亡比例以及分泌炎性因子的情況。利用RT-PCR和Western Blot分析輻射對巨噬細胞NLRP3炎癥小體的影響。分離培養(yǎng)WT型和Nlrp3敲除骨髓巨噬細胞,檢測輻射后巨噬細胞的存活情況、細胞焦亡比例及NLRP3炎癥小體活化相關蛋白表達水平,研究NLRP3炎癥小體在輻射誘導的巨噬細胞焦亡中的作用。體內(nèi)實驗利用免疫熒光和Western Blot分析輻射后WT小鼠和Nlrp3敲除小鼠脾臟NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平,驗證輻射對NLRP3炎癥小體的作用。采用透視電鏡觀察輻射后兩種基因型小鼠脾臟巨噬細胞形態(tài),研究接受輻射后巨噬細胞的損傷方式。通過繪制兩基因型小鼠接受輻射后的生存曲線研究Nlrp3敲除對輻射導致小鼠死亡的整體性保護作用。研究結果一、輻射誘導骨髓巨噬細胞炎癥小體活化和焦亡CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)輻射后骨髓巨噬細胞存活率下降,并呈劑量和時間依賴性。FAMYVAD-FMK和PI標記輻射后骨髓巨噬細胞,顯示雙陽性細胞比例以及培養(yǎng)上清LDH活性增加,并呈劑量依賴性。ELISA檢測細胞上清炎性因子發(fā)現(xiàn)10 Gy和20 Gy輻射后,M1型巨噬細胞相關炎性因子(TNF-α、IFN-γ和IL-12)、炎癥小體活化相關炎性因子(IL-1β和IL-18)以及其他炎性因子(IL-1α和MCP-1)升高。然而,5 Gy輻射后細胞上清中IL-1β、IL-18和IFN-γ含量增加,但TNF-α、IL-12p40、IL-1α和MCP-1含量無明顯變化。此外,骨髓巨噬細胞高劑量輻射(10 Gy和20 Gy)后cleaved-Caspase-1(p10)產(chǎn)生增多,而低劑量輻射(5 Gy)組cleaved-Caspase-1(p10)較對照組無明顯變化。二、Nlrp3敲除顯著抑制輻射誘導的骨髓巨噬細胞炎癥小體活化和焦亡Nlrp3敲除后10 Gy輻射誘導的骨髓巨噬細胞死亡比例從25.98%下降到5.45%,并且10 Gy輻射誘導的骨髓巨噬細胞cleaved-Caspase-1(p10)和IL-1β產(chǎn)生顯著減少。此外,Nlrp3敲除后10 Gy輻射誘導的FAM-YVAD-FMK和PI雙染的骨髓巨噬細胞比例以及LDH活性顯著下降,三、Nlrp3敲除對輻射誘導的損傷具有保護作用9.5 Gy輻射后小鼠脾臟cleaved-Caspase-1(p10)產(chǎn)生增多,血清IL-1β水平增高。Nlrp3敲除輻射(9.5 Gy)組小鼠脾臟cleaved-Caspase-1(p10)產(chǎn)生和血清IL-1β水平較對照組增高不明顯。免疫熒光染色顯示9.5 Gy輻射后小鼠脾臟cleaved-Caspase-1(p10)產(chǎn)生增多并且主要表達于脾臟邊緣區(qū)細胞(富含巨噬細胞),Nlrp3敲除輻射組小鼠脾臟邊緣區(qū)細胞cleaved-Caspase-1(p10)表達與對照組差別不明顯。電鏡結果顯示9.5 Gy輻射后,WT小鼠脾臟巨噬細胞表現(xiàn)出焦亡樣改變(細胞發(fā)生腫脹,細胞表面形成小的空泡并脫落到細胞間隙內(nèi),細胞核未見明顯的固縮、破裂或溶解),而Nlrp3敲除輻射(9.5 Gy)組小鼠脾臟巨噬細胞未見明顯變化。此外,生存分析顯示,Nlrp3敲除輻射(9.5 Gy)組小鼠生存率和生存時間顯著高于WT輻射組小鼠。結論低劑量輻射可以誘導巨噬細胞分泌多種炎性因子,高劑量輻射不僅可以促進巨噬細胞分泌炎性因子,還可以通過活化NLRP3炎癥小體介導巨噬細胞焦亡。靶向抑制NLRP3炎癥小體活化及繼發(fā)的巨噬細胞焦亡,可作為限制輻射誘導的巨噬細胞損傷、促炎反應爆發(fā)和相關組織損傷的一個重要策略。
[Abstract]:In this study , it was found that the activation of NLRP3 was the most important cause of inflammation after radiation induced by radiation . IL - 1尾 , IL - 18 and IFN - 緯 levels were increased in mice after 5 Gy irradiation , but the levels of TNF - 偽 , IL - 12p40 , IL - 1偽 and MCP - 1 were significantly decreased .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.55

【參考文獻】

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1 Shu-Long Wang;Ge Zhao;Wei Zhu;Xiao-Meng Dong;Ting Liu;Yuan-Yuan Li;Wen-Gang Song;Yi-Qiang Wang;;Herpes simplex virus-1 infection or Simian virus 40-mediated immortalization of corneal cells causes permanent translocation of NLRP3 to the nuclei[J];International Journal of Ophthalmology;2015年01期

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本文編號：1478786