本文關(guān)鍵詞： 手足口病 腸道病毒71型 病理學(xué) 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 中和抗體 鼠適株 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) 類病毒顆粒 基因工程疫苗　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：手足口病（Hand,foot and mouth disease, HFMD）是由腸道病毒感染引起的一種嚴(yán)重的傳染病，并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢(shì)。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型（Enterovirus71, EV71），兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣，除典型的HFMD外，還常表現(xiàn)出嚴(yán)重的中樞神經(jīng)疾病及肺水腫和/或肺淤血等并發(fā)癥，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。目前對(duì)于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚，且缺乏有效的預(yù)防及治療方法，常導(dǎo)致臨床醫(yī)療嚴(yán)重后果的發(fā)生，因此明確HFMD病原，全面分析EV71感染后病理改變，探討發(fā)病機(jī)理，以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預(yù)防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據(jù)此，本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā)，從法醫(yī)病理學(xué)、分子病毒學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等幾個(gè)方面對(duì)該病例及其致病病原EV71進(jìn)行了深入的研究，具體內(nèi)容有以下五個(gè)章節(jié)。 第一章以文獻(xiàn)綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景，主要包括HFMD的流行情況，其主要病原體EV71的病毒學(xué)特點(diǎn)，流行病學(xué)研究，致病機(jī)理研究，EV71感染的臨床診斷和治療，疫苗的研究現(xiàn)狀，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇以及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的原理、技術(shù)路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進(jìn)展等。最后說明了本論文研究的內(nèi)容及意義。 第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學(xué)分析方法，對(duì)一例疑似HFMD致死案例進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯，，神經(jīng)細(xì)胞壞死、膠質(zhì)小結(jié)形成、炎細(xì)胞呈袖套樣浸潤(rùn)，肺水腫顯著、炎癥突出，確認(rèn)死因?yàn)椴《拘阅X炎及病毒性肺炎導(dǎo)致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎(chǔ)上利用RT-PCR技術(shù)，以國(guó)家CDC指導(dǎo)的EV71通用檢測(cè)引物，證實(shí)病原體為EV71。隨后針對(duì)EV71保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，檢測(cè)了各病理組織的病毒載量；利用抗EV71VP1蛋白的特異性多克隆抗體對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了病毒抗原的組織分布。結(jié)果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對(duì)較高，其中腦干和頸髓最高；病毒抗原檢測(cè)陽性主要集中在CNS的神經(jīng)細(xì)胞及炎細(xì)胞，為病毒感染復(fù)制的主要部位；肺組織雖病變明顯，水腫/淤血突出，但病毒核酸及抗原陰性，并非病毒主要感染復(fù)制部位； 第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā)，在體外RD細(xì)胞上進(jìn)行病毒的分離、傳代及空斑純化，通過一步法生長(zhǎng)曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異，同時(shí)利用EV71-VP1基因的序列對(duì)病毒株進(jìn)行基因分型。篩選出一株純化病毒，擴(kuò)增出核酸序列進(jìn)行分段克隆，獲得EV71病毒的全基因組，并提交GenBank。結(jié)果顯示：腦干組織能成功分離到EV71-xf活病毒，在RD細(xì)胞上能產(chǎn)生腸道病毒特異性致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect, CPE），透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約20～30nm的EV71病毒粒子。經(jīng)空斑純化后的四株病毒在體外RD細(xì)胞上感染性基本無差別，VP1測(cè)序結(jié)果顯示均為C4亞型；完成了一株病毒的全基因組測(cè)序，基因組全長(zhǎng)為7405bp，GenBank登錄號(hào)(Accession number)為JQ804832，基因組序列提示此次感染病毒仍為國(guó)內(nèi)流行株C4亞型，全基因組序列的測(cè)定將有利于后續(xù)的深入研究。 第四章對(duì)純化的EV71-xf病毒進(jìn)行了建立小動(dòng)物感染模型的初步摸索。通過顱腔注射（Intracranial injection, IC）的途徑使1日齡Balb/c小鼠感染EV71-xf病毒，觀察其表現(xiàn)，隔周采血對(duì)血清特異性抗體IgG及中和抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠，獲得鼠適性毒株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1日齡Balb/c小鼠能通過IC途徑感染EV71-xf，但無明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)；血清抗體IgG在感染兩周后較高，但仍處于亞中和抗體水平；IC二次感染可以刺激小鼠產(chǎn)生更高濃度IgG，并在RD細(xì)胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護(hù)作用；母?jìng)骺贵w的中和保護(hù)作用較強(qiáng)，但時(shí)間短暫，約4w齡時(shí)其保護(hù)作用消失；反復(fù)多次鼠腦適應(yīng)，可以得到感染性增強(qiáng)的鼠適株EV71-xf/A/J/Q，但其毒力情況還需進(jìn)一步研究。 第五章利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)開展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將編碼EV71-xf的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至pFastBac-Dual載體的啟動(dòng)子pPh和pP10下游的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組pFastBac Dual-EV71-xf-3CD-P1質(zhì)粒。重組質(zhì)粒與桿狀病毒Bacmid轉(zhuǎn)座后獲得重組Bacmid Bac-EV71-xf-3CD-P1。提取重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞，獲得重組病毒，重組病毒感染昆蟲細(xì)胞后，表達(dá)的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒（Virus Like Particle, VLPs），經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心進(jìn)行初步的純化，Western Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)與剪切，透射電鏡觀察VLPs顆粒；另外還構(gòu)建了新的穩(wěn)定表達(dá)3CD的細(xì)胞系Sf9-3CD，用于VLPs的構(gòu)建策略。結(jié)果顯示，重組桿狀病毒AcBac-EV71-xf-3CD-P1在Sf9細(xì)胞內(nèi)能同時(shí)表達(dá)前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD，3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結(jié)構(gòu)蛋白，并自組裝為VLPs，經(jīng)蔗糖及氯化銫密度梯度離心等初步純化后，Western Blot顯示VLPs具有VP1的抗原表位，透射電鏡觀察VLPs的形態(tài)、大小及構(gòu)象均類似于天然的EV71病毒粒子，可以作為EV71疫苗的候選物。Sf9-3CD細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)3CD蛋白并剪切P1，形成VLPs，可以作為構(gòu)建VLPs的新途徑。 綜合以上研究?jī)?nèi)容，本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學(xué)分析，確定了其致病病原為腸道病毒EV71，并從病理組織中分離、純化到一株高活性的EV71-xf病毒，完成了該病毒株的病毒感染活性檢測(cè)、全基因組序列測(cè)定、小鼠感染性試驗(yàn)以及基因工程疫苗等初步研究。該研究為致死性EV71病毒感染的組織病變過程的解析和機(jī)理研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為EV71病毒的基因工程疫苗研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)預(yù)防和控制HFMD的工作作出了重要貢獻(xiàn)。
[Abstract]:Foot and mouth disease (Hand foot, and mouth disease, HFMD) is a serious infectious disease caused by enterovirus infection, and has been the trend of high incidence. HFMD were the major pathogens of enterovirus 71 (Enterovirus71, EV71) found that in recent years, children are susceptible population. EV71 children infected with EV71 clinical manifestation diversity, in addition to typical HFMD, they often show severe central nervous diseases and pulmonary edema and / or pulmonary congestion and other complications, serious and even lead to death. The occurrence and development of HFMD caused by EV71 infection is not clear, and the lack of effective prevention and treatment, clinical medical treatment often leads to serious consequences therefore, clear HFMD pathogens, a comprehensive analysis of the pathological changes after EV71 infection, pathogenesis, and the development of safe and effective HFMD vaccine to prevent and control HFMD outbreaks of effective means of. Accordingly, this paper Based on a case of suspected HFMD death, we studied the case and its causative agent EV71 from forensic pathology, molecular virology and animal experiments. The contents are divided into five chapters.
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本文編號(hào)：1455873