本文關(guān)鍵詞： 二維培養(yǎng) 三維培養(yǎng) 成纖維細(xì)胞 電離輻射 適應(yīng)性反應(yīng)　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：低劑量電離輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)(Adaptive response，AR)是指預(yù)先給予的小劑量的電離輻射能使機(jī)體對(duì)其后的大劑量電離輻射產(chǎn)生一定的耐受，減輕大劑量輻射引起的損傷或后果。相關(guān)的機(jī)制主要涉及免疫調(diào)控、活性氧物質(zhì)(Reactiveoxygen species，ROS)、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與p53蛋白有關(guān)的細(xì)胞周期阻滯等方面。由成纖維細(xì)胞等構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)的研究表明，低劑量電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的某些生物效應(yīng)在腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著不可忽視的作用。其有關(guān)的機(jī)制尚不十分明確，有待于進(jìn)一步研究。 三維培養(yǎng)（3-D）是一種模擬體內(nèi)微環(huán)境的一種細(xì)胞培養(yǎng)模式。與單層（二維、2-D）細(xì)胞培養(yǎng)比較，其特點(diǎn)主要體現(xiàn)在細(xì)胞出現(xiàn)極化、形成粘附復(fù)合物以及出現(xiàn)細(xì)胞骨架和細(xì)胞容量的等特征性表現(xiàn)，并導(dǎo)致細(xì)胞表型、功能和信號(hào)調(diào)節(jié)發(fā)生改變，使其更接近體內(nèi)的生理性和病理性表征。3-D培養(yǎng)為模擬體內(nèi)的生理性和病理性環(huán)境、研究分子機(jī)制、體外培養(yǎng)和制作移植用組織提供獨(dú)特的技術(shù)支持和保障。 電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DNAs），可以作為電離輻射生物效應(yīng)的監(jiān)測(cè)手段。磷酸化的H2AX基因(γ-H2AX)參與DNA損傷修復(fù)并聚集在DNA雙鏈斷裂點(diǎn)，常被用來(lái)作為DNA雙鏈斷裂監(jiān)控的指標(biāo)。 目的： 探討多種成纖維細(xì)胞株在2-D及3-D培養(yǎng)條件下不同劑量和劑量率電離輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。 方法： 1、本實(shí)驗(yàn)在2-D及3-D培養(yǎng)條件下培養(yǎng)三種成纖維細(xì)胞株（RMP-4、IMR-90及MEF）。 2、RMP-4細(xì)胞在2-D培養(yǎng)條件下，不同輻射劑量和不同時(shí)間點(diǎn)觀察γ-H2AX焦點(diǎn)和熒光強(qiáng)度，確定最佳輻射劑量和檢測(cè)時(shí)間。 3、輻射劑量范圍以0~100mGy作為低劑量（高劑量率，D1)誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，以1~5Gy作為攻擊劑量(D2)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，時(shí)間間隔6h。 4、通過(guò)免疫熒光分析法檢測(cè)三種成纖維細(xì)胞（RMP-4、IMR-90及MEF）核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)，評(píng)估電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂及低劑量電離輻射所誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。 5、通過(guò)Western blot檢測(cè)各處理組細(xì)胞相關(guān)基因蛋白（p53、p21、p53（ser15））表達(dá)，驗(yàn)證相關(guān)的機(jī)制。 6、在2-D及3-D培養(yǎng)條件下，同一劑量不同劑量率照射RMP-4細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)γ-H2AX焦點(diǎn)，評(píng)估不同劑量率電離輻射誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂程度。 7、在2-D及3-D培養(yǎng)條件下，不同劑量電離輻射照射RMP-4細(xì)胞后，經(jīng)pholloidin染色處理，通過(guò)熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。 8、ImageJ軟件對(duì)蛋白電泳條帶做灰度分析。 9、統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表達(dá)，Student t test或方差分析的方法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0軟件，Origin6.0軟件繪圖。 結(jié)果： 1、電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株RMP-4的DNA損傷時(shí)程/量效分析： RMP-4細(xì)胞在2-D培養(yǎng)條件下，給予2Gy X射線電離輻射照射，然后分別繼續(xù)培養(yǎng)0.5、1、2、4h，通過(guò)免疫熒光分析法觀察γ-H2AX焦點(diǎn)和熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：細(xì)胞在照射后0.5h，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量明顯增多，至1h其數(shù)量達(dá)到高峰，持續(xù)到4h仍然處于明顯增多狀態(tài)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量從對(duì)照組的15%增加到1h的87%，中間的0.5、2、和4h分別為45%、85%和81%，且差異均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 將相同培養(yǎng)條件下的RMP-4細(xì)胞分別給予0、0.1、0.5、1、2和5Gy(0.8676Gy/min)的X射線照射，1h后通過(guò)免疫熒光染色法觀察γ-H2AX焦點(diǎn)和熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：0.1Gy的低劑量即可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞γ-H2AX聚集焦點(diǎn)增加，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量從0Gy組的21%增加到5Gy組的近100%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 上述實(shí)驗(yàn)表明：電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株RMP-4的DNA雙鏈斷裂在一定照射劑量及時(shí)間范圍內(nèi)具有劑量和時(shí)間依賴性。 2、低劑量電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株RMP-4的適應(yīng)性反應(yīng)及機(jī)制 RMP-4細(xì)胞在2-D培養(yǎng)條件下，預(yù)先給予50mGy或100mGy的低劑量X線照射，6h后再給予2Gy攻擊劑量，通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)和熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞由2Gy照射組的87%，分別降低到65%和45%（P0.05）。說(shuō)明預(yù)先給予的低劑量照射可以明顯增加RMP-4細(xì)胞對(duì)隨后給予的2Gy攻擊劑量電離輻射的耐受。將RMP-4細(xì)胞預(yù)先給予D1低劑量預(yù)照射，6h后聯(lián)合D2（2Gy）攻擊劑量照射，然后通過(guò)Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況。經(jīng)條帶灰度分析表明：直接D2的劑量照射組p53、p21和γ-H2AX明顯升高（P0.05），而預(yù)先給予25、50、75和100mGy的D1劑量后再給予2Gy的D2劑量組，與直接給予D2劑量組比較，p21和γ-H2AX蛋白表達(dá)水平明顯降低（P0.05），尤其75mGy+D2組降低最為明顯。但p53蛋白的變化在D1+D2的各處理組變化均不明顯。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將檢測(cè)磷酸化p53（ser15）蛋白表達(dá)情況。 3、低劑量電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株IMR-90適應(yīng)性反應(yīng)及機(jī)制 成纖維細(xì)胞株IMR-90在2-D培養(yǎng)條件下給予D2（2Gy）或者低劑量的D1+D2（6h）的X射線照射，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)γ-H2AX和p53（ser15）表達(dá)和聚集情況，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞焦點(diǎn)數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)分析不同處理組差異。結(jié)果顯示：IMR-90細(xì)胞給予D2攻擊劑量后，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量由平均基礎(chǔ)數(shù)量的10個(gè)/細(xì)胞，增加到40個(gè)/細(xì)胞（P0.05）。但將IMR-90細(xì)胞預(yù)先給予D1（分別為25、50、75和100mGy）誘導(dǎo)劑量后，6h后再次給予D2攻擊劑量照射。細(xì)胞γ-H2AX焦點(diǎn)平均數(shù)量明顯低于單獨(dú)D2劑量組（P0.05）。其中75mGy+D2組焦點(diǎn)數(shù)量相對(duì)最低，約24個(gè)/細(xì)胞。100mGy+D2組焦點(diǎn)平均30個(gè)/細(xì)胞，但仍然明顯低于單獨(dú)D2攻擊劑量組。按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)法統(tǒng)計(jì)各處理組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：假照組、D2組、25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2組，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為20%，98%，97%，60%，50%和80%。各D1+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。通過(guò)Western blot檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：各組蛋白條帶灰度值分別為0、2.9、0.90、0.85、0.70和0.25。各D1+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明：低劑量電離輻射能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株IMR-90對(duì)隨后攻擊劑量D2的照射而產(chǎn)生耐受，即適應(yīng)性反應(yīng)。通過(guò)細(xì)胞免疫熒光分析p53（ser15）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，各組值分別為4%、40%、39%、29%、20%和30%。其中50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。分析Western blot各組條帶灰度值，各組p53（ser15）灰度值為2.0、2.75、2.25、2.25、2.50和2.65。結(jié)果表明：25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。各組p21蛋白條帶相對(duì)灰度值分別為1.80、2.85、2.10、1.65、1.75和1.25。其中50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4、低劑量電離輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株MEF適應(yīng)性反應(yīng)及機(jī)制 成纖維細(xì)胞株MEF在2-D培養(yǎng)條件下給予D2（2Gy）或者低劑量的D1+D2（6h）X射線照射，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)γ-H2AX表達(dá)和焦點(diǎn)聚集情況，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞焦點(diǎn)數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)分析不同處理組差異。結(jié)果顯示：MEF細(xì)胞給予D2攻擊劑量后，細(xì)胞γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量由平均基礎(chǔ)數(shù)量的8個(gè)/細(xì)胞，增加到了35個(gè)/細(xì)胞（P0.05）。但MEF細(xì)胞預(yù)先給予D1（分別為25、50、75和100mGy）誘導(dǎo)劑量后，6h后再次給予D2電離輻射照射。細(xì)胞γ-H2AX焦點(diǎn)平均數(shù)量明顯低于單獨(dú)D2組（P0.05）。其中75mGy+D2組焦點(diǎn)數(shù)量相對(duì)最低，約16個(gè)/細(xì)胞。25mGy+D2和100mGy+D2組焦點(diǎn)平均20個(gè)/細(xì)胞。按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)方法統(tǒng)計(jì)各處理組結(jié)果顯示：假照組、D2組、25mGy+D2、50mGy+D2、75mGy+D2及100mGy+D2組，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為17.5%，84%，69%，49%，45%和70%，各D1+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。其中75mGy+D2組γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例為各處理組中陽(yáng)性細(xì)胞比例最低組。通過(guò)Western blot檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)，并對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明：各組蛋白條帶灰度值分別為0、1.75、0.50、0.32、0.35、和0.45，各D1+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法分析p53（ser15）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，各組值分別為0、20%、15%、15%、5%和5%。分析Western blot條帶灰度值，各組p53（ser15）相對(duì)值分別為0.29、0.65、0.45、0.40、0.40和0.40。各組p21蛋白條帶相對(duì)灰度值分別為0.49、0.78、0.60、0.50、0.40和0.40。p53和p21基因條帶分析結(jié)果表明：各D1+D2組與單獨(dú)D2組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 以上結(jié)果說(shuō)明，低劑量電離輻射能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞株對(duì)隨后攻擊劑量的D2電離輻射照射而產(chǎn)生耐受，即適應(yīng)性反應(yīng)，且p53和p21基因與低劑量電離輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)有明顯的相關(guān)性。 5、2-D與3-D培養(yǎng)條件下電離輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的比較 成纖維細(xì)胞株RMP-4分別在2-D和3-D培養(yǎng)條件下，并給予0.5Gy X射線照射，劑量率分別為低（LDR）0.0184Gy/min、中(MDR)0.2Gy/min和高(HDR)0.8676Gy/min劑量率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種條件下培養(yǎng)的RMP-4細(xì)胞經(jīng)電離輻射照射后，隨著劑量率的增加，γ-H2AX焦點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量隨之增多。2-D組γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為4.9%、5.2%、11%和46%（P0.05）；3-D組γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為6%、9%、17%和72%（P0.05）。提示相同照射劑量下不同劑量率對(duì)2-D和3-D培養(yǎng)條件下的DNA雙鏈斷裂損傷的結(jié)局均存在明顯差異，且3-D培養(yǎng)條件下差異更加明顯（P0.05）。說(shuō)明3-D培養(yǎng)條件下，DNA的損傷程度對(duì)劑量率增加表現(xiàn)更為敏感。 為了進(jìn)一步比較2-D和3-D培養(yǎng)條件下電離輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)的差異，通過(guò)熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果顯示：在2-D培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)濃密、伸展并且相互交聯(lián)在一起，經(jīng)X射線照射后細(xì)胞胞體卷曲。3-D培養(yǎng)條件下，表現(xiàn)為細(xì)胞個(gè)體清晰、舒展，且胞體飽滿。當(dāng)細(xì)胞給予0.1、0.5或2Gy電離輻射照射后，，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，一部分細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的異常形態(tài)，表現(xiàn)為偽足消失、細(xì)胞卷曲等。另有一部分細(xì)胞處于正常和異常形態(tài)之間，我們定義為中間態(tài)，從結(jié)果可見(jiàn)，3-D培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)對(duì)電離輻射的反應(yīng)更加生動(dòng)、具體及形象。 2-D培養(yǎng)條件下，RMP-4細(xì)胞給予2Gy或者75mGy+2Gy照射，顯微鏡下觀察RMP-4細(xì)胞形態(tài)并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：2-D培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)致密而伸展，相互交織，2Gy X射線照射后細(xì)胞則皺縮卷曲，但紋理仍清晰，經(jīng)75mGy+2Gy照射后，細(xì)胞沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)變化；3-D培養(yǎng)條件下，細(xì)胞給予2Gy或者75mGy+2Gy照射，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明：電離輻射后，3-D培養(yǎng)條件下的異常形態(tài)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，由基礎(chǔ)比例的28%增加到2Gy照射組的80%（P0.05），中間態(tài)的細(xì)胞略有增加（約占5%）。75mGy+2Gy組異常細(xì)胞比例為34%明顯低于2Gy組異常細(xì)胞比例，但高于對(duì)照組（P0.05）。75mGy+2Gy組中間態(tài)的細(xì)胞增加至占20%，明顯高于2Gy組（P0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：3-D培養(yǎng)條件與2-D培養(yǎng)條件相比較更易觀察到成纖維細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，這可能與3-D培養(yǎng)條件更接近細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)的真實(shí)環(huán)境，相對(duì)更容易激活其他信號(hào)通路，從而激活細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)。 結(jié)論 1、低劑量電離輻射可誘導(dǎo)2-D和3-D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)； 2、適應(yīng)性反應(yīng)在3-D培養(yǎng)條件下比2-D培養(yǎng)條件下更容易被誘導(dǎo)，可能存在潛在的致死性損傷修復(fù)機(jī)制； 3、p53和p21可能參與到低劑量電離輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)，低劑量電離輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入的研究； 4、3-D培養(yǎng)條件下更有利于從形態(tài)學(xué)上觀察電離輻射誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)。 綜上所述，本研究課題建立細(xì)胞3-D培養(yǎng)模式用來(lái)模擬體內(nèi)條件，采用免疫熒光法和Western blot檢測(cè)和驗(yàn)證2-D培養(yǎng)條件下低劑量電離輻射所誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)及其可能機(jī)制；并對(duì)比觀察在2-D和3-D培養(yǎng)條件下不同劑量和劑量率所誘導(dǎo)的適應(yīng)性反應(yīng)的差別及細(xì)胞形態(tài)的差異，為研究3-D培養(yǎng)條件下成纖維細(xì)胞的輻射特性及其對(duì)腫瘤細(xì)胞支持作用研究提供依據(jù)，為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞微環(huán)境在電離輻射治療腫瘤中的作用及機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R818

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 鞠桂芝,閆鳳琴,付士波,李鵬武;電離輻射誘導(dǎo)P21蛋白表達(dá)及對(duì)細(xì)胞周期解偶聯(lián)的作用[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);2005年04期

2 劉自民;于洪升;崔復(fù)憲;;低劑量輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的研究進(jìn)展[J];齊魯醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

本文編號(hào)：1455690