本文關(guān)鍵詞： 巨核細(xì)胞 遷移 血小板前體 交感神經(jīng)興奮 血小板生成　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,隨著核能在軍事、醫(yī)療、能源、食品加工、育種等鄰域的廣泛應(yīng)用,機(jī)體受到射線照射而引發(fā)的各種放射性損傷也在逐漸增加。已知骨髓對(duì)電離輻射非常敏感,因此,骨髓受到射線照射后,極易引起放射性損傷。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)機(jī)體受到電離輻射后,會(huì)引起骨髓多系造血功能障礙,其中由巨核系造血功能障礙引起的血小板水平數(shù)量減少可以導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)以出血、感染、代謝紊亂為代表的多種癥狀,甚至可出現(xiàn)死亡。因此,深入認(rèn)識(shí)血小板生成的調(diào)控機(jī)制,并尋找有效促進(jìn)輻射損傷后血小板水平恢復(fù)的手段,是輻射損傷救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明,機(jī)體受照后,射線可直接作用于生物大分子,造成DNA鏈斷裂,蛋白失活,或者細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或通透性改變,造成細(xì)胞損傷;電離輻射還可通過作用于水分子產(chǎn)生輻射分解產(chǎn)物,后者會(huì)再次作用于生物大分子,從而加重細(xì)胞損傷。此外,我室早期研究輻射損傷時(shí),程天民院士等曾觀察到一種“巨核細(xì)胞被噬”(megakaryocytophagia)的現(xiàn)象,該現(xiàn)象提示骨髓巨核細(xì)胞又可以被中性粒細(xì)胞吞噬。因此,機(jī)體受到放射損傷后骨髓巨核細(xì)胞(megakaryocyte,MK)和外周血血小板數(shù)量降低尤為顯著。針對(duì)該現(xiàn)狀,人們不斷尋找能夠促進(jìn)血小板生成的藥物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以血小板生成素(thrombopoietin,TPO)為代表的促血小板生成因子可通過作用于巨核細(xì)胞生成的多個(gè)階段,誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)增殖、分化形成成熟MKs并釋放出血小板,從而有效促進(jìn)放射損傷后血小板水平恢復(fù)。遺憾的是,TPO體內(nèi)應(yīng)用并不能縮短血小板處于低谷期的時(shí)間,并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體,從而使其應(yīng)用受到一定限制;而IL-11又是FDA批準(zhǔn)使用的唯一促血小板生成藥物。因此,尋找新的、更多的促進(jìn)放射損傷后血小板水平恢復(fù)的手段顯得尤為必要。在研究電離輻射引起血小板數(shù)量減少的過程中,人們發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)外界因素作用于機(jī)體后,會(huì)引起機(jī)體內(nèi)包括交感—腎上腺髓質(zhì)(sympathetic-adrenal medulla system,SAS)軸在內(nèi)的多個(gè)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)軸做出綜合性適應(yīng)反應(yīng),其中SAS軸釋放的去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)和腎上腺素(epinephrine,EPI)等兒茶酚胺類物質(zhì)可通過與不種組織和細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合,從而而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。研究表明,骨髓有豐富的交感神經(jīng)支配,交感神經(jīng)興奮后,sas軸釋放的ne和epi在造血調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。前期研究結(jié)果證實(shí),ne和epi不僅能夠促進(jìn)cd34+細(xì)胞增殖,調(diào)控造血干/祖細(xì)胞的遷移;ne和epi還可通過對(duì)hscs的子代細(xì)胞產(chǎn)生一系列影響,如sas釋放的ne或epi可通過與不同的腎上腺素受體結(jié)合,從而調(diào)控淋巴細(xì)胞生成和紅細(xì)胞生成,并參與血小板活化等過程。但是,交感神經(jīng)支配是否參與了血小板生成的調(diào)控,目前還未見相關(guān)報(bào)道。因此,深入研究交感神經(jīng)興奮在血小板生成和活化過程中的作用,不僅有助于進(jìn)一步解讀交感神經(jīng)的功能,揭示血小板生成的調(diào)控機(jī)制,而且可以為放射損傷后血小板水平恢復(fù)的救治提供新思路。長期以來,本室緊緊圍繞放射損傷引起血小板數(shù)量減少的發(fā)生原因,致力于血小板生成調(diào)控機(jī)制研究和相關(guān)基因工程藥物研發(fā)。在研究中,我們發(fā)現(xiàn)小鼠在應(yīng)激狀態(tài)下外周血血小板處于高水平。因此,我們首先通過復(fù)制噪音和超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)應(yīng)激模型,觀察連續(xù)應(yīng)激刺激后小鼠外周血血小板水平變化,分析連續(xù)應(yīng)激刺激是否能夠促進(jìn)血小板生成。在此基礎(chǔ)上,采用腎上腺素受體阻斷,β羥基轉(zhuǎn)移酶缺陷(dbh-/-)小鼠以及血小板生成素tpo受體缺陷(c57bl/6j-mplhlb219/j)小鼠等手段,證實(shí)交感神經(jīng)興奮是促進(jìn)體內(nèi)血小板生成的重要因素;體外采用多種分析方法,檢測(cè)ne和epi對(duì)cd34+細(xì)胞增殖和分化、巨核細(xì)胞定向分化、增殖、粘附和遷移、血小板前體形成、以及血小板釋放和活化等多個(gè)血小板生成階段的影響,分析交感神經(jīng)興奮促進(jìn)血小板生成和活化的具體機(jī)制;最后,復(fù)制放射損傷小鼠模型,探討交感神經(jīng)興奮對(duì)放射損傷小鼠的血小板水平促恢復(fù)作用。通過上述研究,取得的結(jié)果與結(jié)論如下:1、復(fù)制了噪音和超負(fù)荷運(yùn)動(dòng)應(yīng)激模型,發(fā)現(xiàn)c57bl/6小鼠受到連續(xù)應(yīng)激刺激后血小板水平逐漸升高,提示連續(xù)應(yīng)激刺激能夠升高機(jī)體外周血血小板水平;進(jìn)一步通過綜合分析脾臟切除小鼠、多巴胺β-羥化酶缺陷(dopamineβ-hydrolylasedeficient,dbh-/-)小鼠以及c57bl/6j-mplhlb219/j小鼠連續(xù)應(yīng)激后血小板數(shù)量變化,證實(shí)交感神經(jīng)興奮具有促進(jìn)血小板生成的作用。2、在巨核細(xì)胞生成早期階段,流式檢測(cè)結(jié)果表明,ne和epi雖然具有促進(jìn)cd34+細(xì)胞增殖的作用,但不能促進(jìn)cd34+細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化,也不能促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖。3、熒光酶標(biāo)儀和transwell檢測(cè)結(jié)果提示,ne和epi能夠以劑量依賴方式促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移;α受體阻斷后,ne和epi誘導(dǎo)粘附和遷移的細(xì)胞數(shù)目顯著減少,表明ne和epi通過α受體促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移;4、westernblot分析發(fā)現(xiàn),ne和epi處理可增強(qiáng)erk1/2磷酸化蛋白的表達(dá),但α及α2受體阻斷后,erk1/2的磷酸化蛋白表達(dá)顯著減弱,提示ne和epi具有通過α2受體激活ERK1/2通路的能力;進(jìn)一步阻斷α2受體和ERK1/2信號(hào)通路后,發(fā)現(xiàn)NE和EPI誘導(dǎo)粘附和遷移的巨核細(xì)胞數(shù)目顯著減少,證實(shí)NE和EPI能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移。5、激光共聚焦結(jié)果顯示,NE和EPI能夠以劑量依賴方式促進(jìn)晚期巨核細(xì)胞形成血小板前體,提示NE和EPI具有促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化的作用。6、NE和EPI能夠上調(diào)晚期巨核細(xì)胞RhoA磷酸化蛋白的表達(dá);RhoA GTP酶活性抑制后,NE和EPI誘導(dǎo)血小板前體形成的偽足延長,形成典型的“串珠樣”結(jié)構(gòu),提示NE和EPI的促血小板前體形成作用與RhoA GTP酶的活性相關(guān)。7、α2受體和ERK1/2通路阻斷可抑制NE和EPI誘導(dǎo)的RhoA磷酸化蛋白表達(dá),并導(dǎo)致血小板前體的形成數(shù)目顯著減少,提示NE和EPI通過α2受體,激活ERK1/2-RhoA通路,是NE和EPI促進(jìn)血小板前體形成的具體機(jī)制。8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),NE和EPI能夠促進(jìn)晚期巨核細(xì)胞生成血小板,進(jìn)一步證實(shí)NE和EPI主要作用于巨核細(xì)胞終末分化階段而促進(jìn)血小板生成。9、Western Blot和流式細(xì)胞儀結(jié)果綜合提示,NE和EPI與α2受體結(jié)合,激活ERK1/2通路,可能是NE和EPI促進(jìn)血小板活化的具體機(jī)制。10、體內(nèi)研究結(jié)果提示,NE和EPI腹腔注射具有促進(jìn)巨核細(xì)胞向血管龕遷移,從而升高C57BL/6小鼠外周血血小板水平的作用,表明NE和EPI體內(nèi)能夠促進(jìn)血小板生成。11、成功復(fù)制重度放射損傷小鼠血小板減少癥動(dòng)物模型(6.0 Gyγ射線全身一次性照射)。外周血血小板數(shù)量動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,NE和EPI體內(nèi)應(yīng)用可顯著升高受照小鼠外周血血小板水平;表明交感神經(jīng)興奮具有促進(jìn)放射損傷小鼠血小板水平恢復(fù)的作用。12、復(fù)制了重度急性輻射損傷后骨髓移植動(dòng)物模型(10.0 Gyγ射線照射后接受骨髓移植),在在血小板水平處于最低值時(shí)給予交感神經(jīng)刺激可以顯著加快血小板水平恢復(fù)速度,減輕出血傾向,進(jìn)一步證實(shí)交感神經(jīng)刺激具有促進(jìn)放射損傷小鼠血小板水平恢復(fù)的作用�？傊�,通過本實(shí)驗(yàn)我們首先發(fā)現(xiàn)了交感神經(jīng)興奮具有促進(jìn)血小板生成的作用,并初步探討了該作用對(duì)放射損傷所致血小板減少癥的救治意義。該研究進(jìn)一步豐富了人們對(duì)交感神經(jīng)功能的認(rèn)識(shí),填補(bǔ)了交感神經(jīng)在血小板生成調(diào)控研究領(lǐng)域的空白,同時(shí)也為臨床放射損傷的救治提供了新的線索。
[Abstract]:In recent years , as nuclear energy has been widely used in military , medical , energy , food processing , breeding , etc . , various radioactive damage caused by radiation exposure has been increasing . Bone marrow is known to be very sensitive to ionizing radiation . In this study , it is necessary to study the effect of sympathetic nerve stimulation on the platelet count . In this study , it is shown that NE and epi can not only promote cd34 + cell proliferation and regulate the migration of hematopoietic stem / progenitor cells . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . The results and conclusions are as follows : 1 . It is suggested that NE and epi can promote the adhesion and migration of eukaryotic cells . The results suggest that NE and EPI can promote the formation of thrombocyte precursors by NE and EPI . It is suggested that NE and EPI can promote the formation of platelet precursors . The results of dynamic monitoring of platelet count in peripheral blood indicate that the application of NE and EPI can significantly increase the blood platelet level of irradiated mice . It is shown that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelets in irradiated mice . In conclusion , we have found that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelets in radiation injury mice . In conclusion , we have found that sympathetic nerve stimulation has the effect of promoting the recovery of platelet in radiation injury mice .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R818

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