本文關(guān)鍵詞： 甲醇 視網(wǎng)膜 視網(wǎng)膜電圖 蛋白質(zhì)組學(xué) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：甲醇是重要的化工原料和有機(jī)溶劑,是工業(yè)用酒精的主要成分之一,由于其價(jià)格低廉、來源廣泛,且具有微弱的乙醇香味,時(shí)常被一些不法分子用于制造假酒,引起群體性中毒事件并造成惡劣的社會(huì)影響；在生活和生產(chǎn)中,通過皮膚接觸或是呼吸道吸入致甲醇急慢性中毒的案例也時(shí)有發(fā)生。急性中毒多因誤服甲醇代替乙醇作為飲料所致,由于多數(shù)患者不會(huì)意識到飲用假酒這一事實(shí),臨床診斷和治療往往不夠及時(shí)和準(zhǔn)確,甚至于漏診,以至于造成極其嚴(yán)重的后果。中毒者以視力障礙和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀較為突出,嚴(yán)重者甚至于死亡,并且即使經(jīng)過搶救等及時(shí)治療,視力障礙也通常難以完全恢復(fù)。因甲醇中毒死亡或致殘的,多會(huì)釀成嚴(yán)重的刑事案件或民事糾紛。中毒后幸存者往往需要鑒定損傷程度和傷殘等級的評定,有時(shí)也會(huì)涉及中毒與不良后果之間因果關(guān)系的鑒定,其中又常涉及視覺功能檢驗(yàn),這就需要我們對甲醇中毒對視網(wǎng)膜的毒性作用和損害機(jī)制有全面、深入的了解。 作為甲醇毒性的一個(gè)重要靶器官,視網(wǎng)膜的宏觀功能、微觀結(jié)構(gòu)、分子組成等方面在甲醇的毒性作用下都會(huì)發(fā)生一定改變。視網(wǎng)膜電圖作為視網(wǎng)膜功能的客觀檢測方法之一,在臨床上被廣泛作為視網(wǎng)膜疾病與視網(wǎng)膜損傷的診斷和治療依據(jù)。由于視網(wǎng)膜電圖各波形可以反應(yīng)視網(wǎng)膜不同細(xì)胞的生物電活動(dòng),所以視網(wǎng)膜電圖不僅可用于評估甲醇對視網(wǎng)膜造成的宏觀功能損害,而且可以在細(xì)胞層面反映視網(wǎng)膜不同細(xì)胞的受損情況。 近年來蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸在毒理學(xué)研究方面嶄露頭角,作為高通量的蛋白質(zhì)研究方法,其不僅可用于篩選生物學(xué)標(biāo)志物,也可為毒理學(xué)作用機(jī)制的研究提供新的方法。本課題在原有研究基礎(chǔ)和研究方法上,將研究甲醇對視網(wǎng)膜功能、形態(tài)以及蛋白質(zhì)分子的毒性作用,并探討甲醇對視網(wǎng)膜的毒性作用機(jī)制。主要的研究內(nèi)容為以下6個(gè)部分： 第一部分甲醇中毒視網(wǎng)膜功能改變研究 為研究不同甲醇劑量和不同毒性作用時(shí)間下的視網(wǎng)膜功能,建立了甲醇中毒的實(shí)驗(yàn)大鼠模型(FR大鼠),并依據(jù)給毒劑量和毒性作用時(shí)間分為中毒劑量3天組,中毒劑量7天組和低劑量3天組、低劑量7天組。依據(jù)ISCEV(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision)規(guī)定方法,分別在暗視和明視狀態(tài)下進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜電圖的檢測,結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究甲醇對視網(wǎng)膜視桿細(xì)胞反應(yīng)、最大混合反應(yīng)和視錐細(xì)胞反應(yīng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)：甲醇毒性致視網(wǎng)膜功能呈現(xiàn)不同程度下降,中毒劑量甲醇對明視、暗視系統(tǒng)損害都較大,暗視系統(tǒng)損害較重呈現(xiàn)進(jìn)行性下降,而明視系統(tǒng)損害進(jìn)展緩慢。較低劑量的甲醇會(huì)造成以暗視系統(tǒng)為主的一過性損害。 第二部分視網(wǎng)膜與肝腎等代謝相關(guān)組織病理形態(tài)學(xué)改變研究 為了研究視網(wǎng)膜在甲醇毒性作用下的組織學(xué)改變,以及組織結(jié)構(gòu)隨時(shí)間改變的特征,我們特取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察其顯微結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)變化。同時(shí)取部分肝腎組織進(jìn)行組織學(xué)比較研究,以研究視網(wǎng)膜對甲醇毒性的敏感性。組織經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片、染色等流程,在光學(xué)顯微鏡下視網(wǎng)膜呈現(xiàn)細(xì)胞水腫和組織疏松,以外層視網(wǎng)膜為甚。透射電子顯微鏡下,發(fā)現(xiàn)線粒體水腫、空泡、嵴斷裂等表現(xiàn)。但不同劑量和不同毒性作用時(shí)間下的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變特點(diǎn)有所不同：中毒劑量的甲醇會(huì)造成光感受器和內(nèi)核層細(xì)胞組織形態(tài)的改變,并且隨中毒時(shí)間延長組織學(xué)改變有加重趨勢；光感受器的線粒體損害早于內(nèi)核層線粒體損害的發(fā)生；低劑量甲醇對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的毒性作用是可逆的；視網(wǎng)膜較其他器官對甲醇更為敏感。 第三部分甲醇血濃度的檢測與分析 為研究甲醇的代謝情況,利用頂空氣相色譜法檢測各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血中的甲醇濃度。頂空氣相色譜法是一種可穩(wěn)定準(zhǔn)確檢測血甲醇的定性定量方法。將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物引頸處死后,取心血及時(shí)保存于EDTA抗凝管中,將1uL的血樣與500uL叔丁醇混合,直接進(jìn)入頂空進(jìn)樣器,每個(gè)樣本經(jīng)檢測器FID1A和FID2B檢查兩次。研究發(fā)現(xiàn)甲醇的保留時(shí)間為1.134min；中毒劑量的甲醇在給藥7天后仍可被檢測到,說明甲醇在體內(nèi)代謝緩慢,存在一定蓄積性。 第四部分甲醇中毒視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究 為研究甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的變化,提取臨床中毒癥狀和視網(wǎng)膜功能障礙最嚴(yán)重的中毒劑量7天組和對正常對照組的視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)并定量,經(jīng)過雙向凝膠電泳分離、凝膠染色和圖像采集分析,認(rèn)定灰度相差3倍以上為的蛋白質(zhì)為差異蛋白,并膠上酶解差異蛋白,經(jīng)過MALDI-TOF-TOF MS質(zhì)譜鑒定,成功篩選出24個(gè)差異蛋白質(zhì),其中上調(diào)的蛋白包括14個(gè),如aldehyde dehydrogenase, tropomyosin alpha-1chain, myosin light chain MLC1, myosin regulatory light chain2, actin gamma1propeptide-like, myosin light chain MLC3, alpha-crystalline A chain (2spots), alpha-crystalline B chain(3spots), beta-crystalline A2, beta-crystalline B2, and beta-crystalline B3下調(diào)的蛋白包括10個(gè),如heat shock protein60, actin cytoplasmic1, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,tubulin beta-2A chain, recoverin, synuclein Beta, Chain A Calmodulin, ATP synthase (H+transporting, mitochondrial F1complex, alpha subunit), ATP synthase subunit alpha, zero beta-globin. a晶狀體蛋白B經(jīng)western blot驗(yàn)證確系明顯上調(diào)。 差異蛋白種類和功能涉及到細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、與代謝及線粒體功能相關(guān)蛋白、視網(wǎng)膜特有結(jié)構(gòu)和功能蛋白。從毒性反應(yīng)分析,甲醇對視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)造成的影響一方面在于甲醇及其代謝物對視網(wǎng)膜組織蛋白的直接毒性作用,包括對細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和對線粒體功能相關(guān)蛋白的損害；另一方面的影響在于引發(fā)視網(wǎng)膜自身對毒性作用所做出的保護(hù)性反應(yīng),如晶體蛋白的分子伴侶功能。 第五部分差異性蛋白的亞細(xì)胞定位 為研究差異性蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,采用LOCtree在線服務(wù)軟件,輸入24個(gè)差異性蛋白質(zhì)的氨基酸序列,得到每個(gè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息。其中位于細(xì)胞胞漿的蛋白質(zhì)最多,高達(dá)75%,其次是線粒體16.67%,位于細(xì)胞外以及與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)均為4.17%。亞細(xì)胞定位信息提示除線粒體功能障礙這一經(jīng)典作用途徑外,可能存在線粒體外的其他作用機(jī)制,或是多條途徑相互影響的情況。 第六部分構(gòu)建甲醇中毒視網(wǎng)膜差異性蛋白質(zhì)基因間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò) 為研究差異性蛋白間潛在的信號關(guān)聯(lián)和中毒機(jī)制,基于KEGG數(shù)據(jù)庫,在數(shù)據(jù)庫中搜索滿足篩選條件基因的上游和下游基因,之后根據(jù)基因與其上、下游相互作用關(guān)系畫出基因間連接線。分析發(fā)現(xiàn),ATP5A1(ATP合成酶基因)是中介能力最強(qiáng)的基因；與ATP5A1相互作用的基因數(shù)目最多為高達(dá)40個(gè),所以ATP5A1在整個(gè)Signal-Net中處于一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的位置；位于ATP5A1的下游基因包括細(xì)胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶以及晶體蛋白。再次提示線粒體是重要的中介部位,甲醇可能除了直接影響線粒體代謝而導(dǎo)致視網(wǎng)膜損害外,還對位于線粒體中的ATP合成酶的改變進(jìn)而影響到其下游的細(xì)胞骨架蛋白、甲醛脫氫酶、以及晶體蛋白等的調(diào)節(jié)和功能。 小結(jié) 通過對視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的影響,發(fā)現(xiàn)了不同劑量和不同中毒時(shí)間的甲醇對視網(wǎng)膜功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響不同,甲醇對內(nèi)核層和光感受器細(xì)胞均有損害,光感受器細(xì)胞線粒體損害早于內(nèi)核層線粒體的損害,視桿細(xì)胞較視錐細(xì)胞對甲醇更為敏感；運(yùn)用頂空氣相色譜法,確證了甲醇在體內(nèi)代謝緩慢情況,并發(fā)現(xiàn)甲醇濃度的降低不會(huì)終止視網(wǎng)膜功能和結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步惡化；通過對甲醇中毒后視網(wǎng)膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究,首次篩選出了甲醇對視網(wǎng)膜毒性作用的候選生物學(xué)標(biāo)志物；通過對差異性蛋白的亞細(xì)胞定位研究和構(gòu)建差異蛋白質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò),提示線粒體處于甲醇毒性機(jī)制的中心位置外,存在線粒體外的毒性作用機(jī)制。
[Abstract]:Methanol is an important chemical raw material and organic solvent , it is one of the main components of industrial alcohol . Because of its low cost , wide source , and weak alcohol flavor , it is often difficult to fully recover from acute poisoning due to the fact that alcohol is used instead of ethanol as beverage . As an important target organ of the toxicity of methanol , the macroscopic function , microstructure and molecular composition of the retina can change under the toxic action of methanol . As one of the objective detection methods of retinal function , the electroretinogram is widely used as the basis for diagnosis and treatment of retinal diseases and retinal damage . In recent years , proteomic research has gradually emerged in toxicology research . As a high - throughput protein research method , it can be used not only to screen biological markers , but also to provide new methods for the research of toxicological mechanism . Study on the changes of retinal function in the first part of methanol poisoning In order to study the retinal function in rats with different methanol dose and different toxic action time , the rats model of methanol poisoning ( FR rats ) was established , and the effects of methanol on the response , maximal mixing reaction and optic cone cell response were studied . Study on pathological changes of metabolism - related tissues in the second part of retina and liver and kidney In order to study the histological changes of retina in the toxic action of methanol and the change of tissue structure with time , we studied the microstructure and ultrastructure changes of retina in the light microscope and transmission electron microscope . The Detection and Analysis of the Blood Concentration of the Third Part of Methanol In order to study the metabolism of methanol , the methanol concentration in blood of each group was determined by headspace gas chromatography . Study on the Proteomics of Retinal Proteomics in the Fourth Part of Methanol Poisoning In order to study the changes of retinal protein group after methanol poisoning , the most serious poisoning dose of 7 days and the amount of retinal protein in normal control group were extracted , and 24 differentially expressed proteins were identified by two - way gel electrophoresis separation , gel staining and image acquisition . ATP synthase ( H + ATPase , mitochondrial F1complex , alpha subunit ) , ATP synthase subunit alpha , zero beta - globin . a lens protein B was confirmed by western blot . The effects of methanol and its metabolites on retinal tissue protein are the direct toxic effects of methanol and its metabolites on retinal tissue proteins , including the damage to cytoskeletal - related proteins and proteins associated with mitochondrial function , and on the other hand , the protective effects of the retina itself on the toxic effect , such as the molecular - mate function of crystallin . Subcellular Localization of the Fifth Differential Protein In order to study the sub - cell localization of differential protein , the amino acid sequence of 24 different proteins was input by using the LOCtree on - line service software , and the sub - cell location information of each protein was obtained . The protein located in the cytoplasm of the cells was up to 75 % , followed by the mitochondrial 16.67 % , the protein located outside the cell and the DNA binding protein was 4 . 17 % . The sub - cell location information suggested that there might be other mechanisms of action outside the mitochondria , or multiple ways of interacting with each other , except for the classical pathway of mitochondrial dysfunction . Part 6 : Construction of signal transduction network between protein gene of retinal difference in methanol poisoning It is found that ATP5A1 ( ATP synthase gene ) is the most intermediate gene in the whole Signal - Net . small knot The effects of methanol on retinal function and morphological structure were found by the effects of methanol on retinal function and morphological structure .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：D919.4;R779.13

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1446707