發(fā)布時(shí)間：2017-10-08 00:24

  本文關(guān)鍵詞：膽紅素致神經(jīng)細(xì)胞損傷及全基因組DNA甲基化水平變化的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的采用原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),建立膽紅素神經(jīng)毒性模型,通過檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)變化和細(xì)胞凋亡等觀測(cè)終點(diǎn),進(jìn)一步探討膽紅素所致神經(jīng)毒性損害的特征,初步探討膽紅素染毒神經(jīng)細(xì)胞全基因組DNA甲基化水平的變化,為進(jìn)一步探究高膽紅素血癥致神經(jīng)損傷的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。方法(1)選取健康SD大鼠新生鼠(24h以內(nèi)),體外原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,選用Neurobasal無血清培養(yǎng)基(Invitrogen,美國(guó))在37℃,5%CO2濕潤(rùn)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞,并利用NSE免疫熒光法鑒定細(xì)胞種類；(2)培養(yǎng)3d的細(xì)胞(D3)經(jīng)膽紅素25、50、100μM處理4、12、24、48h后,通過MTT法檢測(cè)膽紅素染毒后的細(xì)胞活力；(3)通過HE染色觀察細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)變化；(4)利用Hoechst33342進(jìn)行熒光標(biāo)記,通過熒光顯微鏡觀察膽紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況；(5)利用Fluo-3熒光探針進(jìn)行標(biāo)記,通過熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化；(6)使用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司,中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性變化；(7)使用大鼠總Tau蛋白酶聯(lián)免疫檢疫試劑盒(上海CrystalDay Biotech公司,中國(guó))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白表達(dá)量的變化；(8)經(jīng)膽紅素系列濃度(0、25、50和100μM)處理24h后,利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞全基因組DNA甲基化水平。結(jié)果(1)采用原代神經(jīng)細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù),建立了膽紅素神經(jīng)毒性模型；經(jīng)NSE免疫熒光檢測(cè),確定細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞；(2)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)膽紅素染毒后,胞體減小,細(xì)胞核固縮,神經(jīng)突變細(xì)、縮短,神經(jīng)節(jié)點(diǎn)減少,細(xì)胞間連接稀疏；(3)MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著染毒劑量增加,細(xì)胞活力下降,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；同時(shí),膽紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降也顯示了明顯的時(shí)間依賴性。(4)膽紅素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞核發(fā)生偏集、固縮和碎裂。隨著染毒劑量的增加和染毒時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞凋亡率明顯上升；(5)膽紅素破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+富集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)的濃度呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。(6)膽紅素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性增加。隨著染毒劑量增加或染毒時(shí)間的增長(zhǎng),Caspase-3的活性顯著性增加；(7)膽紅素會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白含量的改變。隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白含量上升；染毒12h后,細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白含量開始出現(xiàn)明顯變化(F3,20=13.391,p=0.002),當(dāng)染毒時(shí)間達(dá)到48h時(shí),Tau蛋白含量開始下降(F3,20=13.313,p=0.002)；(8)膽紅素會(huì)引起細(xì)胞表觀遺傳學(xué)上的變化。在染毒24h后,實(shí)驗(yàn)組的全基因組DNA甲基化水平較對(duì)照組明顯上升(F3,28=11.218,p=0.001)。結(jié)論(1)膽紅素會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)改變,神經(jīng)細(xì)胞活力下降,凋亡率上升等神經(jīng)毒性反應(yīng)。(2)膽紅素會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),并提高Caspase-3活性。另外,膽紅素會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)總Tau蛋白含量的上升,這可能與膽紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。(3)在本實(shí)驗(yàn)研究條件下,膽紅素可提高全基因組DNA甲基化水平,為進(jìn)一步研究高膽紅素血癥致神經(jīng)損傷的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：膽紅素 神經(jīng)細(xì)胞 原代培養(yǎng) 神經(jīng)毒性 DNA甲基化 總Tau蛋白
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 前言10-14
• 1.1 膽紅素與高膽紅素血癥10
• 1.2 高膽紅素血癥的表現(xiàn)10-11
• 1.3 高膽紅素血癥的神經(jīng)毒性11-13
• 1.4 表觀遺傳學(xué)與發(fā)育神經(jīng)學(xué)13
• 1.5 研究的目的、意義13-14
• 2 材料與方法14-25
• 2.1 材料和儀器14-17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 主要儀器15-16
• 2.1.4 溶液配制16-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 2.2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)17-18
• 2.2.2 神經(jīng)細(xì)胞鑒定18
• 2.2.3 細(xì)胞染毒18
• 2.2.4 細(xì)胞病理學(xué)觀察18-19
• 2.2.5 細(xì)胞活力MTT法檢測(cè)19
• 2.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)19-20
• 2.2.7 細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)20
• 2.2.8 蛋白定量20-21
• 2.2.9 Caspase-3活性檢測(cè)21-22
• 2.2.10 細(xì)胞內(nèi)總Tau含量檢測(cè)22-23
• 2.2.11 DNA甲基化檢測(cè)23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖24
• 2.4 統(tǒng)計(jì)處理24-25
• 3 結(jié)果25-35
• 3.1 原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的鑒定25
• 3.2 膽紅素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞活力的影響25-26
• 3.3 膽紅素導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變26-27
• 3.4 膽紅素誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加27-29
• 3.5 膽紅素導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞Caspase-3活性增強(qiáng)29-30
• 3.6 膽紅素破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)30-31
• 3.7 膽紅素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞總Tau表達(dá)的影響31-32
• 3.8 膽紅素對(duì)DNA甲基化的影響32-35
• 4 討論35-41
• 4.1 膽紅素體外模型建立方法35-36
• 4.1.1 神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)35-36
• 4.1.2 神經(jīng)細(xì)胞染毒36
• 4.2 膽紅素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷36-41
• 4.2.1 膽紅素導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞活力下降36-37
• 4.2.2 病理學(xué)改變37
• 4.2.3 膽紅素通過誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡37-38
• 4.2.4 膽紅素破壞神經(jīng)細(xì)胞微管穩(wěn)定性38-39
• 4.2.5 膽紅素影響神經(jīng)細(xì)胞全基因組DNA甲基化水平39-41
• 5 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 在學(xué)期間研究成果48-49
• 致謝49

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王天成;賈光;王起恩;張金華;韓春華;程有全;沈惠麒;;膽紅素拮抗間二硝基苯致大鼠肝細(xì)胞DNA氧化損傷作用[J];環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué);2006年05期

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本文編號(hào)：990953