本文關(guān)鍵詞：Tricellulin在鉛暴露誘導(dǎo)血—腦脊液屏障通透性改變中的作用及機制研究

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【摘要】：鉛作為一種生活中廣泛應(yīng)用但具有毒性的重金屬，能夠造成人體多個系統(tǒng)和器官功能紊亂和損傷，尤其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)的損傷最為嚴重。兒童由于其發(fā)育、代謝的特點，對鉛的神經(jīng)毒性尤為敏感，能夠嚴重影響兒童CNS發(fā)育，造成智力下降，認知功能異常等。鉛神經(jīng)毒性的作用機制包括多個方面，近年來研究提示血腦屏障通透性改變在鉛神經(jīng)毒性中的作用越來越引起人們的重視。 血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、血-腦脊液屏障(blood-cerebrospinal fluidbarrier，BCB)在維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。BCB是血腦屏障的重要組成部分，位于腦室脈絡(luò)叢的血液和腦脊液之間，主要由脈絡(luò)叢上皮細胞組成，能控制腦脊液的形成和運輸，并限制血液中有害物質(zhì)進入大腦。脈絡(luò)叢上皮細胞之間形成的緊密連接是BCB的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，能有效的阻止有害物質(zhì)從細胞間隙中穿過。緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成，包括occludin家族，claudin家族和JAM家族。近年來，三細胞間緊密連接引起人們的廣泛重視。Tricellulin是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的緊密連接蛋白，由于主要分布在三細胞間，簡稱TRIC。TRIC存在于三個上皮細胞的交界處，不僅是緊密連接的重要組成部分，而且在功能上與跨膜蛋白occludin能形成互補作用。TRIC的分布廣泛，但是其在脈絡(luò)叢細胞中的表達及功能尚未見報道。 BCB是鉛的重要作用靶點之一，鉛暴露能夠引起增加BCB的通透性，從而導(dǎo)致腦內(nèi)鉛含量增加。鉛暴露改變BCB通透性的具體機制尚不完全明確，可能與鉛暴露引起脈絡(luò)叢上皮細胞間緊密連接蛋白claudin-1的表達下降有關(guān)，而TRIC是否在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中發(fā)揮作用尚不清楚。 【目的】 觀察TRIC在脈絡(luò)叢上皮細胞中的表達，探究TRIC在BCB中的作用；建立鉛誘導(dǎo)BCB通透性改變的細胞模型，觀察鉛對TRIC表達水平的影響，并探討TRIC在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變中的作用及調(diào)控機制，從microRNA(miRNA)的角度揭示鉛暴露對TRIC表達的影響，為進一步闡明TRIC在BCB中的功能及其在鉛誘導(dǎo)BCB通透性改變機制中提供理論依據(jù)�！痉椒ā� 1.采用免疫熒光染色、Western blot和PCR的方法檢測不同發(fā)育期SD仔鼠的脈絡(luò)叢細胞和體外培養(yǎng)不同時間的Z310細胞中TRIC的表達及定位情況。 2.利用Z310細胞建立體外BCB模型，進行siRNA轉(zhuǎn)染后，通過檢測跨膜內(nèi)皮電阻(Transendothelial electrical resistance, TEER)和熒光葡聚糖(FITC-dextran)通透性檢測降低TRIC表達對屏障通透性的影響。 3.利用Z310細胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型，采用免疫熒光染色、Western blot、屏障通透性實驗及轉(zhuǎn)染高表達質(zhì)粒等方法檢測TRIC在鉛誘導(dǎo)體外BCB通透性改變中的作用。 4.通過生物信息學分析預(yù)測調(diào)控TRIC的microRNA。采用qRT-PCR等方法檢測鉛暴露后脈絡(luò)叢上皮細胞內(nèi)TRIC相關(guān)microRNA的表達情況，并采用Westernblot、通透性實驗檢測相關(guān)microRNA對TRIC的表達調(diào)控及對BCB通透性的影響。 【結(jié)果】 1. TRIC在體內(nèi)、體外脈絡(luò)叢上皮細胞中均有表達，并參與BCB的形成 免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRIC在脈絡(luò)叢上皮細胞存在表達，主要在三細胞連接處分布，并且與occludin有共定位現(xiàn)象。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，TRIC在脈絡(luò)叢上皮細胞和永生化大鼠脈絡(luò)叢細胞Z310中均有表達，，并且隨著仔鼠的發(fā)育和培養(yǎng)時間的延長，TRIC mRNA和蛋白表達呈逐漸升高趨勢。TEER和熒光葡聚糖通透性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低TRIC的表達可引起TEER下降至對照組的84%（P0.05），葡聚糖通透性增加至對照組的1.5倍（P0.05），提示TRIC在BCB通透性中發(fā)揮重要作用。 2.鉛暴露能降低TRIC的表達和分布 通過加入5μM和10μM的醋酸鉛，利用Z310細胞建立鉛暴露誘導(dǎo)體外BCB通透性改變模型，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)鉛暴露72h后能顯著降低TRIC的蛋白表達（P0.05）；免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)鉛暴露后TRIC在細胞間的分布明顯減少（P0.05）。 3.高表達TRIC能抑制鉛暴露引起的體外BCB的損傷 TEER和FITC-dextran通透性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉛暴露能引起體外BCB的通透性增加；轉(zhuǎn)染高表達TRIC質(zhì)粒后可增加TRIC的蛋白表達水平，并且TRIC在三細胞間的分布也明顯增加；高表達TRIC能部分降低鉛暴露誘導(dǎo)的體外BCB通透性改變程度（P0.05）。 4. miR-203可能通過調(diào)控TRIC蛋白，參與鉛誘導(dǎo)的BCB通透性改變 生物信息學預(yù)測顯示，miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA；qRT-PCR結(jié)果顯示，鉛暴露能引起脈絡(luò)叢上皮細胞和Z310細胞中miR-203表達升高；加入miR-203inhibitor能有效抑制miR-203的表達（P0.05），并且降低miR-203的表達能部分抑制鉛誘導(dǎo)的TRIC蛋白表達下降（P0.05），在一定程度上減輕鉛對體外BCB的損傷作用。 【結(jié)論】 1.體內(nèi)、體外實驗均證實TRIC在脈絡(luò)叢上皮細胞間存在表達，且其蛋白含量隨發(fā)育不斷增加，提示TRIC參與BCB的緊密連接的形成；降低TRIC能影響B(tài)CB功能的正常發(fā)揮。 2.鉛暴露能引起Z310細胞中TRIC蛋白表達下降并引起TRIC在細胞間分布減少；高表達TRIC后能夠在一定程度上降低鉛暴露引起的BCB通透性增加，提示TRIC可能在鉛誘導(dǎo)的BCB通透性增加中發(fā)揮重要作用。 3.生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-203可能是調(diào)控TRIC的microRNA；鉛暴露能改變脈絡(luò)叢上皮細胞中的miR-203的表達，而抑制miR-203的表達能有效減少鉛對TRIC蛋白表達的影響，并且在一定程度上抑制鉛暴露造成的BCB通透性改變。 綜上所述，我們的研究結(jié)果證實了TRIC在脈絡(luò)叢上皮細胞的表達和分布，并發(fā)現(xiàn)其在鉛暴露誘導(dǎo)BCB屏障損傷中的作用。本研究將為TRIC在BCB中的功能及其在鉛神經(jīng)毒性機制中作用提供理論依據(jù)，并為鉛誘導(dǎo)BCB通透性損傷的機制提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：Tricellulin 鉛 緊密連接蛋白 血-腦脊液屏障 MicroRNA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-30
• 1 鉛的神經(jīng)毒性16-21
• 2 血-腦脊液屏障與神經(jīng)系統(tǒng)疾病21-27
• 3 MircoRNA 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)27-30
• 實驗一 Tricellulin 在脈絡(luò)叢細胞中的表達與功能30-51
• 1 材料30-36
• 2 方法36-44
• 3 結(jié)果44-49
• 4 討論49-51
• 實驗二 TRIC 在鉛暴露誘導(dǎo)血-腦脊液屏障通透性改變中的作用51-62
• 1 材料51-52
• 2 方法52-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-62
• 實驗三 microRNA 在鉛誘導(dǎo) TRIC 表達改變及血-腦脊液屏障損傷中的作用62-72
• 1 材料62
• 2 方法62-66
• 3 結(jié)果66-70
• 4 討論70-72
• 小結(jié)72-73
• 參考文獻73-80
• 個人簡歷和研究成果80-81
• 致謝81

【參考文獻】

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1 張學偉;郭紀鋒;艾三喜;胡雅岑;孫啟英;徐倩;呂占云;李凱;董曉麗;沈璐;江泓;潘乾;夏昆;嚴新翔;唐北沙;;中國漢族帕金森病人microRNA-7變異分析(英文)[J];中南大學學報(醫(yī)學版);2012年12期

本文編號：990198