本文關鍵詞：三鄰甲苯磷酸酯誘導PC12細胞自噬相關蛋白含量變化的研究

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【摘要】：目的 有機磷化合物(organophosphorus compounds, OPs)是一類用途廣泛、種類繁多的化學品,主要用作殺蟲劑、塑化劑、潤滑劑、添加劑以及戰(zhàn)爭毒劑等。有機磷化合物不但可以引起急性中毒,部分有機磷化合物還能在人和敏感動物引起一種嚴重的、不可逆的遲發(fā)性神經(jīng)損害——有機磷酸酯誘導的遲發(fā)性神經(jīng)病(organophosphorus ester induced delayed neuropathy, OPIDN) 三鄰甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate TOCP)是第1個被確認的能引起遲發(fā)性神經(jīng)毒性的有機磷化合物。到目前為止,國內(nèi)外學者對OPIDN的研究已經(jīng)超過1個世紀,然而OPIDN的發(fā)病機制仍不清楚,因此臨床上對OPIDN缺乏有效的防治措施,預后較差。 本研究以大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)染毒TOCP,建立OPIDN離體細胞模型,研究TOCP染毒后PC12細胞自噬活性和自噬相關蛋白的變化,以及自噬相關蛋白變化的可能機制,從有機磷神經(jīng)毒物干擾神經(jīng)元自噬角度探討OPIDN的發(fā)生機制,為OPIDN防治提供科學依據(jù)。 方法 1MTT法確定TOCP對細胞增殖的抑制作用濃度范圍 2TOCP染毒細胞模型和藥物干預模型的建立 常規(guī)方法培養(yǎng)PC12細胞至對數(shù)期后染毒TOCP,分別研究TOCP對自噬活性影響的劑量-反應關系和時間-反應關系。劑量-反應關系研究的具體分組：設0、0.05、0.10、0.25、0.50mM TOCP5個組,染毒24h；時間-反應關系研究的具體分組：利用0.05mM濃度的TOCF染毒細胞,設0、6、12、24、48h5個觀察點,并收集細胞。 在藥物干預實驗中,提前20min分別給予苯甲基磺酰氟(PMSF)、calpain特異性抑制劑(ALLN)和caspase抑制劑(Ac-DEVD-CHO),再染毒TOCP,然后研究干預藥物對TOCP引起的自噬活性變化的影響(包括劑量-反應關系和時間-反應關系)。 3形態(tài)學觀察 熒光顯微鏡觀察,利用MDC染色觀察PC12細胞中的自噬體的形成,利用免疫熒光檢測自噬相關蛋白的表達。 4自噬相關蛋白含量的檢測 取染毒或干預后的細胞,經(jīng)細胞裂解液處理后,4℃12000*g離心10min,取上清,BCA法進行蛋白定量,Western-blotting技術檢測細胞中自噬相關蛋白表達的變化。 結(jié)果 1MTT法結(jié)果顯示,隨著染毒劑量的增加和染毒時間的延長,TOCP對大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞PCI2增殖有抑制作用。 2MDC染色試驗發(fā)現(xiàn)TOCP染毒后PC12細胞自噬體數(shù)量顯著減少,且自噬體數(shù)量與TOCP染毒濃度和TOCP作用時間呈負相關。 3免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)TOCP染毒細胞后顯著影響了Beclin-1和p62蛋白的表達。隨著TOCP染毒劑量的增加或者染毒時間的延長,Beclin-1蛋白的橙紅色熒光逐漸減弱,而p62蛋白的黃綠色熒光逐漸增強。應用PMSF和ALLN抑制劑分別干預后,再重復上述試驗,則發(fā)現(xiàn)Beclin-1蛋白的橙紅色熒光表達增強,而p62蛋白的黃綠色熒光強度則不同程度地減弱。 4Western-blotting技術檢測發(fā)現(xiàn),隨著TOCP染毒濃度的增高,Beclin-1、 UVRAG、LC3和pro-caspase-3的含量均出現(xiàn)下降,而p62、μ-calpain以及活化的caspase-3含量則有不同程度增加,并呈現(xiàn)明顯的劑量-反應關系(P0.05)。同時,隨著TOCP染毒時間的延長,TOCP染毒顯著抑制了自噬相關蛋白Beclin-1、 UVRAG、LC3以及pro-caspase-3的水平,增加了p62、μ-calpain和活性caspase-3的水平,并呈現(xiàn)出明顯的時間-反應關系(P0.05)。 5提前給予PMSF、Calpain抑制劑以及Caspase抑制劑,再染毒TOCP, Western-blotting結(jié)果顯示3種抑制劑均不同程度上抑制了TOCP誘導的自噬相關蛋白Beclin-1、UVRAG、LC3以及p62的變化和caspase的激活。 結(jié)論 1TOCP染毒PC12細胞后引起了細胞自噬活性的降低。 2TOCP染毒干擾了PC12細胞中自噬相關蛋白Beclin-1、UVRAG、LC3、 p62、 calpain以及caspase-3的表達。 3PMSF、Calpain抑制劑以及Caspase抑制劑預處理均能不同程度地預防TOCP誘導的PC12細胞自噬活性的下降和自噬相關蛋白的變化。 4Calpain和Caspase-3激活引起的神經(jīng)細胞自噬活性變化可能涉及到OPIDN的發(fā)病機制。
【關鍵詞】：三鄰甲苯磷酸酯(TOCP) 有機磷酸酯類化合物誘導的遲發(fā)性神經(jīng)病(OPIDN) 自噬 自噬相關蛋白
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-20
• 材料與方法20-28
• 1 試劑與儀器20-21
• 2 實驗方法與步驟21-28
• 實驗結(jié)果28-55
• 3.1 TOCP對PC12細胞增殖的影響28-29
• 3.2 MDC染色觀察TOCP誘導PC12細胞自噬體數(shù)量的變化29-34
• 3.3 免疫熒光檢測自噬相關蛋白Beclin-1、p62蛋白表達情況34-38
• 3.4 Western blotting檢測自噬相關蛋白的表達情況38-55
• 討論55-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-70
• 致謝70-71
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文71-72
• 學位論文評閱及答辯情況表72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 王凱軍;Caspase家族與眼科疾病[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;2001年04期

2 李慧展,楊家琳,牛青盟;三鄰甲苯磷酸酯中毒74例臨床分析[J];中國工業(yè)醫(yī)學雜志;1997年03期

3 韓曉英,趙秀蘭,程東,朱振平,于麗華,謝克勤;三鄰甲苯基磷酸酯對雞大腦組織細胞骨架蛋白含量的影響[J];中國藥理學與毒理學雜志;2005年02期

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本文編號：984928