本文關(guān)鍵詞：六價(jià)鉻暴露與p16基因啟動子區(qū)DNA甲基化之間關(guān)系的研究

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【摘要】：目的 本研究的目的是將人群調(diào)查和體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)合,研究六價(jià)鉻暴露對p16基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)的影響,并明確p16基因DNA甲基化在調(diào)控p16基因及蛋白表達(dá)中的可能作用及其在六價(jià)鉻誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯中的作用,從而為六價(jià)鉻毒性機(jī)制的研究提供依據(jù)。 方法 在人群調(diào)查中,選取某電鍍廠工人192例作為六價(jià)鉻暴露組,對照組80例選自不同電鍍企業(yè)且與暴露組年齡、性別、吸煙史、飲酒史等條件相近的后勤及管理人員,近3個(gè)月內(nèi)無接觸有毒有害化學(xué)物質(zhì)和電離輻射史。采集兩組人群肝素抗凝外周血后,用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)檢測血鉻濃度,從全血中提取基因組DNA,用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR, MSP)測定P16基因啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài),用酶聯(lián)免疫法測定兩組人群血漿中8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)及p16蛋白的含量。按照工齡將六價(jià)鉻暴露人群分為長期(36個(gè)月)和短期暴露組(≤36個(gè)月),用x2檢驗(yàn)分析接觸時(shí)間對p16甲基化是否有影響。并分析各氧化應(yīng)激指標(biāo)與p16甲基化之間的相關(guān)性。 在體外實(shí)驗(yàn)中,用0,5,10,15μM的K2Cr207和0,1.25,2.5,5μg/cm2的PbCrO4分別處理人B淋巴母細(xì)胞系和肺A549細(xì)胞系,K2Cr2O7和PbCrO4的染毒時(shí)間分別為2h,24h與4h,24h。染毒結(jié)束后收集細(xì)胞,使用(Propidium Iodide, PI)熒光染料結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞周期。提取細(xì)胞中的DNA、總RNA及蛋白質(zhì),用甲基化DNA定量檢測試劑盒檢測總的DNA甲基化率,用MSP法和焦磷酸測序法測定P16基因啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài),用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測CDK4、CDK6及p16基因mRNA的表達(dá)水平,用Western Blot技術(shù)檢測p16蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 六價(jià)鉻暴露人群血鉻顯著高于對照人群(p0.01)；暴露人群外周血DNA中p16基因啟動子區(qū)DNA甲基化率顯著高于對照人群(p0.000)；兩組人群血漿中p16蛋白的表達(dá)水平無顯著差異(p0.05)。六價(jià)鉻暴露人群中,暴露時(shí)間對p16基因的甲基化改變無顯著影響(x2=1.36,p0.05),而血漿三個(gè)氧化應(yīng)激指標(biāo)只有GSH的含量與p16甲基化間存在一定的負(fù)相關(guān)(r=-0.156,p0.05)。 K2Cr2O7和PbCrO4短期(2h/4h)處理對兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期無明顯影響。重鉻酸鉀和鉻酸鉛處理24h后,人B淋巴母細(xì)胞系各處理組G1期細(xì)胞數(shù)均顯著高于對照組(p0.01),S期細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組(p0.05,p0.01),G2期細(xì)胞數(shù)均沒有顯著改變。A549細(xì)胞中、高劑量組發(fā)生G1期阻滯及G2/M期細(xì)胞數(shù)的降低,但S期細(xì)胞數(shù)沒有改變。 K2Cr2O7和PbCrO4處理均可降低兩種細(xì)胞系基因組DNA的總甲基化(5-mC%)水平,且呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。在人B淋巴母細(xì)胞系中,2h/4h處理組DNA總甲基化水平的降低程度比24h處理組更明顯。MSP和焦磷酸測序結(jié)果均顯示兩種細(xì)胞系p16基因啟動子區(qū)都處于超甲基化狀態(tài),且重鉻酸鉀和鉻酸鉛處理對其DNA甲基化狀態(tài)無明顯影響。 兩種細(xì)胞系經(jīng)K2Cr2O7和PbCrO4分別處理2h和4h后,p16、CDK4和CDK6基因的表達(dá)水平無明顯改變。經(jīng)5-15μM的K2Cr2O7及2.5-5μg/cm2的PbCrO4處理24h后,A549細(xì)胞系p16基因的mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(p0.01), CDK4和CDK6基因的mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組相(p0.05,p0.01)。重鉻酸鉀和鉻酸鉛處理24h對人B淋巴母細(xì)胞系p16、CDK4和CDK6基因表達(dá)水平的影響與A549細(xì)胞類似,但PbCrO4處理24h后,人B淋巴母細(xì)胞系CDK4基因表達(dá)未改變,p16基因mRNA表達(dá)升高亦僅出現(xiàn)在1.25μg/cm2處理組。高濃度重鉻酸鉀和鉻酸鉛處理24h可致兩種細(xì)胞系p16蛋白表達(dá)水平升高,人B淋巴母細(xì)胞系15μM K2Cr207處理組及A549細(xì)胞系5.0μg/cm2PbCrO4處理組,p16蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組(p0.05)。 結(jié)論 職業(yè)接觸六價(jià)鉻可致暴露人群p16基因啟動子區(qū)DNA甲基化率高于對照人群、血漿GSH含量低于對照人群,但兩組人群p16蛋白表達(dá)無顯著差異,GSH含量與p16基因DNA甲基化之間呈負(fù)相關(guān)�？扇苄院筒蝗苄粤鶅r(jià)鉻化合物均可致人B淋巴母細(xì)胞系和A549細(xì)胞系發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯,且其可能和p16基因表達(dá)上調(diào)、CDK4/6基因表達(dá)下調(diào)及DNA總甲基化水平降低有關(guān),但六價(jià)鉻化合物對兩種細(xì)胞系p16基因的上調(diào)作用并非通過DNA甲基化途徑實(shí)現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：重鉻酸鉀 鉻酸鉛 六價(jià)鉻 DNA甲基化 細(xì)胞周期 基因表達(dá) p16基因
【學(xué)位授予單位】：浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-19
• 材料與方法19-31
• 結(jié)果與分析31-49
• 1. 人群調(diào)查31-34
• 1.1 暴露和對照人群血鉻比較31
• 1.2 暴露和對照人群P16基因啟動子區(qū)DNA甲基化率比較31
• 1.3 暴露和對照人群血漿P16蛋白表達(dá)水平比較31-32
• 1.4 暴露和對照人群血漿8-OHDG、MDA、GSH水平比較32-33
• 1.5 氧化應(yīng)激和P16基因DNA甲基化之間相關(guān)性分析33
• 1.6 工齡對P16基因啟動子區(qū)DNA甲基化的影響33-34
• 2. 體外實(shí)驗(yàn)34-49
• 2.1 六價(jià)鉻對兩種細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響34-38
• 2.2 六價(jià)鉻誘導(dǎo)的DNA總甲基化水平改變38-39
• 2.3 六價(jià)鉻對P16基因啟動子區(qū)DNA甲基化的影響39-42
• 2.4 六價(jià)鉻對P16基因表達(dá)的影響42-44
• 2.5 六價(jià)鉻下調(diào)CDK4基因表達(dá)44-45
• 2.6 六價(jià)鉻下調(diào)CDK6基因表達(dá)45-47
• 2.7 六價(jià)鉻對P16蛋白表達(dá)水平的影響47-49
• 討論與建議49-52
• 結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 綜述59-65
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 附件1 (攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄)65-66
• 附件2 (攻讀學(xué)位期間參加的項(xiàng)目及會議)66

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：979825