本文關鍵詞：丙烯酰胺對大鼠突觸損傷的毒作用機制研究

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【摘要】：目的丙烯酰胺(Acrylamide, ACR)是一種水溶性的乙烯基單體,常溫下為白色固體結(jié)晶,主要用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺,廣泛應用于飲用水凈化、污水處理、化妝品生產(chǎn)、染料、礦石加工、造紙、生物實驗(如凝膠色譜和凝膠電泳)等行業(yè),經(jīng)食用高溫烹飪食物也可攝入一定量的ACR。動物實驗表明,ACR可經(jīng)呼吸道、皮膚、胃腸道等多種途徑進入機體,具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性等(國際癌癥研究中心(IARC,1994)已將其列為“人類可能致癌物"2A類)。其中,人類流行病學調(diào)查已明確ACR對人體的神經(jīng)毒性：職業(yè)中毒病例常見于聚丙烯酰胺合成、污水處理、建筑工程灌漿等操作,發(fā)病人員有明顯的神經(jīng)中毒癥狀和體征,如四肢無力、共濟失調(diào)、肢端痛覺過敏、振動覺和位置覺減退等。本研究通過建立ACR亞急性染毒動物模型,探討ACR對大鼠神經(jīng)毒性的效應,包括大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glutamate, Glu)和γ-氨基丁酸(y-aminobutyric acid, GABA)的含量改變,中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷及突觸囊泡的分布狀態(tài),突觸素Ⅰ(Synapsin I)、磷酸化突觸素Ⅰ(P-Synapsin I)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的蛋白表達變化,以此為ACR所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患提供實驗動物學的證據(jù)并為其毒作用機制的最終闡明提供一定的實驗數(shù)據(jù)支撐。方法1.建立動物模型：選取成年雄性SD大鼠,隨機分為11d實驗組和21d實驗組：11d實驗組設生理鹽水(NS)對照組、30mg/kg ACR染毒組和50mg/kg ACR染毒組；21d實驗組設生理鹽水(NS)對照組、15mg/kg ACR染毒組和30mg/kgACR染毒組；2.體重變化：實驗開始后每天稱量大鼠體重并記錄；3.神經(jīng)行為變化：實驗開始后每天對動物的大體行為表現(xiàn)和異常體征進行觀察記錄；11d實驗組于第7、11d進行步態(tài)評分；21d實驗組于第7、14、21d進行步態(tài)評分；4.中樞神經(jīng)系統(tǒng)Glu和GABA含量的測定：染毒期結(jié)束時,取大鼠大腦皮層和小腦,LC-MS/MS法測定其大腦皮層和小腦的Glu和GABA的含量；5.中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷及突觸囊泡分布狀態(tài)的變化：制備大鼠大腦皮層和小腦石蠟切片,HE染色觀察大腦皮層和小腦的病理變化；制備大鼠大腦皮層和小腦標本,電鏡觀察神經(jīng)損傷的超微結(jié)構(gòu)并對突觸囊泡的分布狀態(tài)進行定量分析；6.中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關蛋白的組織定位：免疫組化法確定大鼠大腦皮層和小腦Synapsin I、P-Synapsin I的蛋白分布；7.中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關蛋白表達量的變化：Western-blot法測定大鼠大腦皮層和小腦Synapsin I、P-Synapsin I、BDNF蛋白表達量的變化。結(jié)果1.體重變化15mg/kg ACR染毒組大鼠體重與對照組相比變化不顯著(P0.05)；30mg/kgACR染毒組體重在第13d進入平臺期,隨后逐步下降；50mg/kg ACR染毒組大鼠體重自第7d開始下降。lld實驗組染毒終點時,50mg/kg ACR染毒組大鼠體重與NS對照組、30mg/kg ACR染毒組相比顯著降低(P0.05)。21d實驗組染毒終點時,30mg/kg ACR染毒組大鼠體重與NS對照組、15mg/kg ACR染毒組相比顯著降低(P0.05)。2.神經(jīng)行為變化15mg/kg ACR染毒組大鼠在染毒期間步態(tài)變化不顯著,30mg/kg ACR染毒組和50mg/kg ACR染毒組大鼠在染毒期間均出現(xiàn)后肢無力、震顫、拖步直至后肢完全癱瘓。lld實驗組在染毒終點時,50mg/kg ACR染毒組大鼠步態(tài)評分與NS對照組、30mg/kg ACR染毒組相比顯著增加(P0.05)。21d實驗組在染毒終點時,30mg/kg ACR染毒組大鼠步態(tài)評分與NS對照組、15mg/kg ACR染毒組相比顯著增加(P0.05)。3.大腦皮層和小腦Glu和GABA含量的變化(1)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)：大腦皮層和小腦在不同劑量ACR染毒終點(30mg/kg 21d、50mg/kg11d), Glu含量均顯著降低,且降低幅度一致；(2)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)：大腦皮層GABA含量變化在兩種染毒條件下并不完全一致,在30mg/kg 21d染毒終點,大腦皮層GABA含量顯著增高(P0.05),但在50mg/kg 11d染毒終點其含量并無顯著變化；在兩種實驗條件下,小腦的GABA含量均未發(fā)生顯著變化。4.中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷及突觸囊泡分布狀態(tài)的變化4.1大腦皮層和小腦的病理損傷HE染色結(jié)果：ACR染毒可致大鼠大腦皮層神經(jīng)元與周圍組織間隙增寬,染色質(zhì)嗜堿性增強；小腦浦肯野細胞形狀不規(guī)則變化且與周圍組織間隙明顯增寬,伴有浦肯野細胞部分丟失。電鏡結(jié)果：ACR亞急性染毒可致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元固縮、核膜凹陷；膠質(zhì)細胞水腫；血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞；線粒體損傷；多聚核糖體解聚；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴張等。4.2突觸數(shù)量的變化隨ACR染毒濃度的增加,大鼠大腦皮層和小腦內(nèi)突觸數(shù)量逐漸降低。30mg/kg ACR染毒組與NS對照組相比,大鼠大腦皮層和小腦的突觸數(shù)量顯著降低(P0.05),50mg/kg ACR染毒組與對照組、30mg/kg ACR染毒組相比,大鼠大腦皮層和小腦的突觸數(shù)量均顯著降低(P0.05)。在ACR染毒終點,50mg/kg ACR染毒組與對照組相比,大腦皮層和小腦的突觸數(shù)量降低幅度基本一致,均降低約50%。4.3大腦皮層和小腦突觸囊泡分布狀態(tài)的變化隨ACR染毒濃度的增加,突觸囊泡的分布變得分散,大腦皮層和小腦突觸囊泡與突觸活性區(qū)的最近距離(active zone distance, AZD)、突觸囊泡間的最短距離(nearest neighbor distance. NND)均呈增加趨勢,30mg/kg ACR染毒組與NS對照組比較NND顯著增加(P0.01),50mg/kg ACR染毒組與NS對照組、30mg/kg ACR染毒組比較AZD. NND均顯著增加(P0.01)。ACR染毒可改變大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前部突觸囊泡在易釋放池(readily releasable pool, RRP)和儲存池(reserve pool, RP)的分布比例,對NS對照組、30mg/kg ACR染毒組、50mg/kg ACR染毒組大腦皮層和小腦RRP、RP囊泡分布比例分別進行兩兩比較均有統(tǒng)計學差異(P0.01)；趨勢性檢驗結(jié)果表明大腦皮層和小腦RRP囊泡比例隨ACR染毒濃度增加而減少,RP囊泡比例隨ACR染毒濃度增加而增加(P0.01)。5. Synapsin I、P-Synapsin I在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織定位免疫組化法結(jié)果表明,大鼠大腦皮層的Synapsin I和P-Synapsin I免疫反應產(chǎn)物均為棕色顆粒且分布位置一致：可見陽性顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍,襯托出神經(jīng)元胞體的輪廓；大鼠小腦的Synapsin I和P-Synapsin I免疫反應產(chǎn)物均為棕色顆粒且分布位置一致：在浦肯野細胞層,深染的顆粒樣物質(zhì)圍繞在浦肯野細胞周圍,呈脈絡狀向分子層延伸,襯托出樹突分支的輪廓,顆粒層也可見免疫陽性產(chǎn)物的分布。6.ACR染毒對大鼠大腦皮層和小腦Synapsin I、P-Synapsin I、BDNF蛋白表達的影響隨ACR染毒濃度的增加,大鼠大腦皮層和小腦內(nèi)Synapsin I、P-Synapsin I的含量均逐漸降低。30mg/kg ACR染毒組與NS對照組相比,大鼠大腦皮層和小腦的Synapsin I、P-Synapsin I含量顯著降低(P0.05),50mg/kg ACR染毒組與對照組、30mg/kg ACR染毒組相比,大鼠大腦皮層和小腦的Synapsin I、P-SynapsinⅠ含量均降低顯著(P0.05)。在ACR染毒終點,50mg/kg ACR染毒組與對照組相比,大腦皮層和小腦的Synapsin I含量降低幅度基本一致,均降低約50%。ACR染毒可致大鼠大腦皮層和小腦內(nèi)BDNF的含量增加,30mg/kg ACR染毒組、50mg/kg ACR染毒組與NS對照組相比,大鼠大腦皮層和小腦的BDNF含量均顯著增加(P0.05)。結(jié)論1.大腦皮層和小腦興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(Glu/GABA)的測試結(jié)果表明,ACR亞急性染毒致大鼠大腦皮層和小腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu含量的降低具有變化趨勢的一致性和重現(xiàn)性,可能為其神經(jīng)毒性的致病機制之一；ACR可能主要通過下調(diào)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平,降低興奮性/抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的比重而發(fā)揮神經(jīng)毒作用；2.ACR亞急性染毒可致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)破壞、膠質(zhì)細胞水腫、血腦屏障結(jié)構(gòu)破壞、線粒體損傷、多聚核糖體解聚、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體擴張等,還可減少大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸數(shù)量,改變突觸前部突觸囊泡的分布狀態(tài),增加大腦皮層和小腦AZD、NND,降低RRP囊泡分布比例,從而影響大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放,造成相應的神經(jīng)功能障礙；3.ACR亞急性染毒可降低大腦皮層和小腦Synapsin I、P-Synapsin I的蛋白表達量,可能是導致AZD增加、NND增加、RRP囊泡分布比例降低的原因；ACR亞急性染毒可短時增加BDNF的蛋白表達水平以增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗損傷能力,起到一定的保護作用。
【關鍵詞】：丙烯酰胺 谷氨酸 γ-氨基丁酸 突觸素Ⅰ 突觸囊泡
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 英文縮寫詞表18-19
• 第一章 丙烯酰胺亞急性染毒對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸、γ-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響19-32
• 引言19
• 材料與方法19-23
• 1. 主要儀器和試劑19-20
• 2. 實驗動物20
• 3. 試劑配制20-21
• 4. 實驗方法21-23
• 5. 統(tǒng)計學方法23
• 結(jié)果23-29
• 1. 體重變化23-24
• 2. 神經(jīng)行為學變化24-25
• 3. 大腦皮層和小腦Glu和GABA含量變化25-29
• 討論29-31
• 小結(jié)31-32
• 第二章 丙烯酰胺亞急性染毒對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷及突觸囊泡分布狀態(tài)的影響32-56
• 引言32-33
• 材料與方法33-38
• 1. 主要儀器和試劑33-34
• 2. 實驗動物34
• 3. 試劑配制34
• 4. 實驗方法34-38
• 5 統(tǒng)計學方法38
• 結(jié)果38-53
• 1. 大腦皮層和小腦的病理損傷38-42
• 2. 突觸數(shù)量變化42
• 3. 突觸囊泡分布狀態(tài)變化42-53
• 討論53-55
• 小結(jié)55-56
• 第三章 丙烯酰胺亞急性染毒對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸素Ⅰ、磷酸化突觸素Ⅰ、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響56-70
• 引言56-57
• 材料與方法57-64
• 1. 主要儀器和試劑57-58
• 2. 實驗動物58
• 3. 試劑配制58-59
• 4. 實驗方法59-63
• 5. 統(tǒng)計學方法63-64
• 結(jié)果64-68
• 1. 大鼠大腦皮層和小腦Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ的分布位置64
• 2. ACR染毒對大鼠大腦皮層Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ、BDNF蛋白表達影響64-66
• 3. ACR染毒對大鼠小腦Synapsin Ⅰ、P-Synapsin Ⅰ、BDNF蛋白表達影響66-68
• 討論68-69
• 小結(jié)69-70
• 總結(jié)70-72
• 參考文獻72-75
• 致謝75-76
• 攻讀學位期間發(fā)表論文76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郭雄雄;嚴漢英;朱蘭蘭;曾立愛;熊飛嚴紅;;丙烯酰胺對大鼠神經(jīng)行為和黑質(zhì)紋狀體多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響[J];衛(wèi)生研究;2011年04期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 肖經(jīng)緯;丙烯酰胺神經(jīng)損傷的突觸素I靶點效應機制及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的干預研究[D];中國疾病預防控制中心;2013年

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本文編號：933304