本文關(guān)鍵詞：實時可視化PMA-LAMP方法檢測三種食源性微生物活菌方法研究

  更多相關(guān)文章： LAMP 可視化 實時 快速檢測 PMA 食源性致病菌 霍亂弧菌 副溶血性弧菌 沙門氏菌

【摘要】：當(dāng)今社會,由食源性致病菌引起的食物中毒情況依舊十分嚴(yán)峻,對全世界尤其是發(fā)展中國家的食品衛(wèi)生安全造成巨大的威脅。在世界范圍內(nèi),沙門氏菌和副溶血性弧菌是最為常見的兩種引起食物中毒的致病菌,而霍亂弧菌則時常引起霍亂的暴發(fā)流行,嚴(yán)重威脅著人們的生命財產(chǎn)安全。因此,建立相應(yīng)的快速檢測手段至關(guān)重要。目前,各類免疫、分子相關(guān)的快速檢測技術(shù)逐漸趨于完善和成熟,但它們普遍存在需要專業(yè)人員、價格昂貴等缺點,并且不能區(qū)分食品中存在的活菌與死菌,這勢必加大檢測結(jié)果假陽性的可能性,造成不必要的恐慌和資源浪費。針對上述難題,本論文建立可視化PMA-LAMP快速檢測技術(shù)來檢測這三種食源性致病菌活菌,一方面解決LAMP技術(shù)存在的兩個方法學(xué)基礎(chǔ)問題,一方面為食品安全的診斷防治提供新思路和技術(shù)平支持。本研究根據(jù)霍亂弧菌thy A基因(Gen Bank登錄號:AY143429.1)、副溶血性弧菌tox R基因(Gen Bank登錄號:GQ228073.1)、沙門氏菌inv A基因(Gen Bank登錄號:M90846.1)、沙門氏菌fim Y基因(Gen Bank登錄號:JQ665438.1)的相關(guān)序列,分別設(shè)計LAMP和熒光定量PCR引物,并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。經(jīng)過優(yōu)化,確定可視化LAMP反應(yīng)的體系如下:20 m M Tris-HCl(p H 8.8),10 m M KCl,8 m M Mg SO4,10 m M(NH4)2SO4,0.1%Tween 20,0.8 M甜菜堿(Betaine),d NTPs各1.4 m M,0.4μM F3/B3,3.2μM FIP/BIP,1.6μM LF/LB,0.3 M鈣黃綠素(Calcein),0.5 M Mn Cl2,8U Bst DNA聚合酶,2.5μL DNA模板。由于鈣黃綠素的熒光特性和SYBR Green I相近,因此反應(yīng)結(jié)果分別可以從熒光曲線和顏色變化兩個方面進(jìn)行鑒定,前者是實時半定量分析,后者是肉眼直接觀察的定性分析。特異性試驗和靈敏度試驗結(jié)果顯示,霍亂弧菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的LAMP引物特異性良好,檢出限分別為1.1×102 CFU/m L、5.0×101CFU/m L、6.3×102-6.3×103 CFU/m L。q PCR結(jié)果和LAMP結(jié)果一致。對于PMA的處理條件,確定暗室孵育時間為5 min,LED燈曝光時間為30min,然后對霍亂弧菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的PMA處理濃度及待處理的最高死菌濃度進(jìn)行優(yōu)化,得到PMA濃度分別為15μM、20μM和5μM,并且,PMA能高效處理最多105 CFU/m L濃度的死菌。將優(yōu)化好的PMA處理步驟結(jié)合可視化LAMP,建立可視化PMA-LAMP,并與PMA-q PCR進(jìn)行對照。在靈敏度試驗中,將梯度稀釋的活菌分別添加到105 CFU/m L的死菌基質(zhì)中,制成死活菌混合液,所得霍亂弧菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的可視化PMA-LAMP檢出限分別為1.1×102 CFU/m L、5.0×102 CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,與PMA-q PCR結(jié)果吻合;在模擬食樣試驗中,按照上述死活菌混合液制備方法制備菌液,然后人工污染干凈的鱈魚或雞蛋樣品。數(shù)據(jù)顯示,霍亂弧菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌可視化PMA-LAMP檢出限則依次為1.7×102 CFU/m L、1.9×102CFU/m L和6.3×103 CFU/m L,結(jié)果與PMA-q PCR一致。在實際樣品檢測中,從市場上隨機(jī)購得海產(chǎn)品、蛋類、蔬菜等新鮮樣品,經(jīng)過適當(dāng)時間的前增菌步驟后,分用可視化PMA-LAMP方法、PMA-q PCR方法和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)提供的檢測方法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,霍亂弧菌的檢出率依次為2.5%、2.5%和0%,副溶血性弧菌的檢出率依次為23.6%、20.8%和20.8%,沙門氏菌的檢出率依次為0%、0%和0%。由此可見,可視化PMA-LAMP方法檢測時間短,加上至少6h的前增菌,最快只需要8 h不到的時間,且在儀器條件缺乏的情況下,可采取定性分析的方法來進(jìn)行初篩,提高后續(xù)鑒定的效率。本研究將可視化LAMP技術(shù)與PMA染料結(jié)合,建立霍亂弧菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的可視化PMA-LAMP快速檢測方法,不僅保留可視化LAMP快速簡便、高特異性、高靈敏度、適合現(xiàn)場操作等優(yōu)勢,兼顧PMA染料低毒性和高特異性抑制死菌擴(kuò)增等特點,并且對LAMP方法的熒光半定量檢測做了一系列初探工作,在配備熒光定量PCR儀的條件允許下,可無需依賴新的儀器設(shè)備,對待測樣品進(jìn)行實時分析。該方法為檢測食品中的活的致病微生物搭建了新的技術(shù)平臺,為尤其是偏遠(yuǎn)落后地區(qū)的食品衛(wèi)生安全提供新的檢測思路。
【關(guān)鍵詞】：LAMP 可視化 實時 快速檢測 PMA 食源性致病菌 霍亂弧菌 副溶血性弧菌 沙門氏菌
【學(xué)位授予單位】：中國計量學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-21
• 縮略詞匯總21-22
• 1 緒論22-40
• 1.1 霍亂弧菌22-26
• 1.1.1 霍亂弧菌分類22-23
• 1.1.2 霍亂弧菌的生物學(xué)特性23
• 1.1.3 霍亂弧菌的毒理作用和主要毒力因子23-24
• 1.1.4 霍亂弧菌流行病學(xué)24
• 1.1.5 霍亂弧菌檢測方法研究進(jìn)展24-26
• 1.1.5.1 常規(guī)檢測方法24-25
• 1.1.5.2 免疫學(xué)方法25
• 1.1.5.3 分子生物學(xué)方法25-26
• 1.2 副溶血性弧菌26-29
• 1.2.1 副溶血性弧菌生物學(xué)特性26
• 1.2.2 副溶血性弧菌的致病機(jī)理及相關(guān)基因26-27
• 1.2.3 副溶血性弧菌流行病學(xué)27-28
• 1.2.4 副溶血性弧菌檢測方法現(xiàn)階段研究進(jìn)展28-29
• 1.2.4.1 常規(guī)生化方法28
• 1.2.4.2 免疫學(xué)方法28
• 1.2.4.3 分子生物學(xué)方法28-29
• 1.3 沙門氏菌29-32
• 1.3.1 沙門氏菌分類29
• 1.3.2 沙門氏菌生物學(xué)特性29
• 1.3.3 沙門氏菌毒力因子29-30
• 1.3.4 沙門氏菌流行病學(xué)30
• 1.3.5 沙門氏菌檢測方法研究進(jìn)展30-32
• 1.3.5.1 常規(guī)生化方法30-31
• 1.3.5.2 免疫學(xué)方法31
• 1.3.5.3 分子生物學(xué)方法31-32
• 1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）概述32-37
• 1.4.1 LAMP技術(shù)介紹32-35
• 1.4.1.1 LAMP的原理32-33
• 1.4.1.2 LAMP引物設(shè)計33
• 1.4.1.3 LAMP技術(shù)的特點33-35
• 1.4.2 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物鑒定35
• 1.4.3 基于鈣黃綠素染料的實時可視化LAMP技術(shù)介紹35-36
• 1.4.4 LAMP技術(shù)的應(yīng)用36-37
• 1.5 死活菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展37-38
• 1.5.1 死活菌檢測現(xiàn)狀及相關(guān)檢測方法37-38
• 1.5.1.1 基于RNA水平的檢測37
• 1.5.1.2 基于DNA結(jié)合染料的檢測37-38
• 1.6 本論文研究內(nèi)容及意義38-40
• 1.6.1 本論文研究內(nèi)容38-39
• 1.6.2 本論文研究意義39-40
• 2 食品中霍亂弧菌實時可視化PMA-LAMP方法的建立40-67
• 2.1 實驗材料40-43
• 2.1.1 菌株40-41
• 2.1.2 儀器設(shè)備41
• 2.1.3 主要試劑41-43
• 2.2 實驗方法43-51
• 2.2.1 樣本的制備43-44
• 2.2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)43
• 2.2.1.2 基因組DNA模板的提取43-44
• 2.2.1.3 相關(guān)菌液的制備44
• 2.2.2 LAMP引物和qPCR引物設(shè)計44
• 2.2.3 目的片段的PCR擴(kuò)增44-46
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物回收及純化46-47
• 2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建47-48
• 2.2.5.1 回收純化的PCR產(chǎn)物與載體連接47
• 2.2.5.2 轉(zhuǎn)化47
• 2.2.5.3 菌液PCR初步鑒定47
• 2.2.5.4 重組質(zhì)粒測序與同源性比對分析47-48
• 2.2.5.5 重組質(zhì)粒提取48
• 2.2.6 實時可視化LAMP體系和qPCR體系的建立48-49
• 2.2.6.1 qPCR反應(yīng)體系的建立48-49
• 2.2.6.2 可視化LAMP反應(yīng)體系的建立49
• 2.2.7 可視化LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化49-50
• 2.2.8 可視化LAMP體系特異性實驗及與qPCR體系的比較50
• 2.2.9 可視化LAMP體系靈敏度及與qPCR體系的比較50
• 2.2.10 PMA處理條件優(yōu)化50-51
• 2.2.11 實時可視化PMA-LAMP體系的靈敏度及與PMA-qPCR體系的比較3051
• 2.2.12 模擬食樣實時可視化PMA-LAMP體系與PMA-qPCR體系靈敏度的比較51
• 2.2.13 實際樣品檢測51
• 2.3 結(jié)果與分析51-65
• 2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定51-53
• 2.3.1.1 目的片段電泳鑒定51-52
• 2.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測序鑒定52-53
• 2.3.2 霍亂弧菌可視化LAMP體系優(yōu)化和建立53-56
• 2.3.2.1 Mg~(2+)終濃度優(yōu)化53
• 2.3.2.2 甜菜堿終濃度優(yōu)化53-54
• 2.3.2.3 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化54
• 2.3.2.4 鈣黃綠素終濃度優(yōu)化54-55
• 2.3.2.5 Mn~(2+)終濃度優(yōu)化55-56
• 2.3.3 霍亂弧菌可視化LAMP和qPCR分析方法特異性比較56
• 2.3.4 霍亂弧菌可視化LAMP和qPCR分析方法靈敏度比較56-59
• 2.3.5 PMA濃度優(yōu)化59-60
• 2.3.5.1 PMA濃度范圍初步確定59
• 2.3.5.2 PMA工作濃度優(yōu)化59-60
• 2.3.6 基質(zhì)中細(xì)胞濃度對PMA處理效果的影響60-62
• 2.3.7 霍亂弧菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較62
• 2.3.8 模擬食樣中霍亂弧菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較62-65
• 2.3.9 實時可視化PMA-LAMP檢測方法在實際樣品中的應(yīng)用65
• 2.4 小結(jié)65-67
• 3 食品中副溶血性弧菌實時可視化PMA-LAMP方法的建立67-83
• 3.1 材料與方法67-71
• 3.1.1 實驗材料67-69
• 3.1.1.1 菌種67-68
• 3.1.1.2 儀器設(shè)備68
• 3.1.1.3 主要試劑68-69
• 3.1.2 實驗方法69-71
• 3.1.2.1 樣本的制備69
• 3.1.2.2 副溶血性弧菌LAMP引物和qPCR引物設(shè)計69
• 3.1.2.3 副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備69-70
• 3.1.2.4 實時可視化LAMP體系和qPCR體系的建立70
• 3.1.2.5 實時可視化LAMP和qPCR特異性和靈敏度分析70
• 3.1.2.6 PMA濃度優(yōu)化70-71
• 3.1.2.7 培養(yǎng)基對PMA處理效果的影響71
• 3.1.2.8 PMA處理上限71
• 3.1.2.9 實時可視化PMA-LAMP的靈敏度及與PMA-qPCR的比較71
• 3.1.2.10 實時可視化PMA-LAMP與PMA-qPCR方法模擬食樣實驗71
• 3.1.2.11 實際樣品檢測71
• 3.2 結(jié)果與分析71-81
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定72-73
• 3.2.1.1 目的片段電泳鑒定72
• 3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測序鑒定72-73
• 3.2.2 副溶血性弧菌可視化LAMP和qPCR分析方法特異性比較73
• 3.2.3 副溶血性弧菌可視化LAMP和qPCR分析方法靈敏度比較73-76
• 3.2.4 PMA處理條件優(yōu)化76-78
• 3.2.4.1 PMA濃度優(yōu)化76-77
• 3.2.4.2 PMA處理菌液濃度上限77
• 3.2.4.3 不同培養(yǎng)基對PMA處理效果的影響77-78
• 3.2.5 副溶血性弧菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較78
• 3.2.6 模擬食樣中副溶血性弧菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較78-80
• 3.2.7 實時可視化PMA-LAMP檢測方法在實際樣品中的應(yīng)用80-81
• 3.3 小結(jié)81-83
• 4 食品中沙門氏菌實時可視化PMA-LAMP方法的建立83-98
• 4.1 材料與方法83-87
• 4.1.1 實驗材料83-84
• 4.1.1.1 菌種83
• 4.1.1.2 儀器設(shè)備83-84
• 4.1.2 實驗方法84-87
• 4.1.2.1 樣本的制備84
• 4.1.2.2 沙門氏菌LAMP引物和qPCR引物設(shè)計84-85
• 4.1.2.3 沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備85
• 4.1.2.4 實時可視化LAMP體系和qPCR體系的建立85-86
• 4.1.2.5 實時可視化LAMP和qPCR特異性和靈敏度分析86
• 4.1.2.6 PMA濃度優(yōu)化86
• 4.1.2.7 細(xì)菌濃度對PMA處理效果的影響86
• 4.1.2.8 實時可視化PMA-LAMP的靈敏度及與PMA-qPCR的比較86
• 4.1.2.9 實時可視化PMA-LAMP與PMA-qPCR方法模擬食樣實驗86-87
• 4.1.2.10 實際樣品檢測87
• 4.2 結(jié)果與分析87-96
• 4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定87-88
• 4.2.1.1 目的片段電泳鑒定87
• 4.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒測序鑒定87-88
• 4.2.2 沙門氏菌可視化LAMP和qPCR分析方法特異性比較88-89
• 4.2.3 沙門氏菌可視化LAMP和qPCR分析方法靈敏度比較89-90
• 4.2.4 PMA處理條件優(yōu)化90-93
• 4.2.4.1 PMA濃度優(yōu)化90-92
• 4.2.4.2 PMA處理菌液濃度上限92-93
• 4.2.5 沙門氏菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較93-94
• 4.2.6 模擬食樣中沙門氏菌實時可視化PMA-LAMP和PMA-qPCR分析方法靈敏度的比較94-95
• 4.2.7 實時可視化PMA-LAMP檢測方法在實際樣品中的應(yīng)用95-96
• 4.3 小結(jié)96-98
• 5 討論98-100
• 5.1 LAMP引物設(shè)計98
• 5.2 實時LAMP的初步探索98
• 5.3 樣品的前增菌和稀釋98-99
• 5.4 基因組DNA提取99
• 5.5 鈣黃綠素染料的注意事項99-100
• 6 總結(jié)、創(chuàng)新與展望100-102
• 6.1 總結(jié)100-101
• 6.2 創(chuàng)新點101
• 6.3 展望101-102
• 參考文獻(xiàn)102-110
• 作者簡歷110-111

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：913096