本文關(guān)鍵詞：基于2D和3D Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)研究納米氧化鋅的安全性

  更多相關(guān)文章： 納米氧化鋅 Caco-2細(xì)胞 三維 細(xì)胞毒性 炎癥反應(yīng) 細(xì)胞死亡

【摘要】：納米氧化鋅是一種應(yīng)用前景廣泛的多功能無(wú)機(jī)納米材料,其具有粒徑微小、比表面活性高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于化妝品、電子產(chǎn)品、藥物載體、醫(yī)藥和食品包裝材料。隨著人們與納米氧化鋅接觸的日益增多,其對(duì)人類健康的潛在毒性影響也引起了高度關(guān)注。研究納米材料對(duì)細(xì)胞毒性的眾多試驗(yàn)中,二維(2D)單層細(xì)胞培養(yǎng)仍然是占主導(dǎo)地位的體外模型。在傳統(tǒng)2D塑料培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)失去其原有的組織結(jié)構(gòu),極性以及蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)相互作用,而且相比體內(nèi)模型往往會(huì)改變細(xì)胞的代謝、表型以及基因表達(dá)。當(dāng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模型擴(kuò)展到納米毒理學(xué)研究,它的這些限制有可能導(dǎo)致獲得誤導(dǎo)性結(jié)果和結(jié)論的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)際上在體內(nèi)的所有細(xì)胞都生長(zhǎng)在一個(gè)三維(3D)環(huán)境中,單個(gè)細(xì)胞的表型和功能是高度依賴于三維組織-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和鄰近細(xì)胞的復(fù)雜相互作用。因此,在一個(gè)高度模擬體內(nèi)生理環(huán)境的體外3D模型中進(jìn)行納米粒子的毒性研究可以為納米材料的生物安全性評(píng)價(jià)提供更多理論基礎(chǔ)和參考價(jià)值。為了評(píng)估不同粒徑的納米氧化鋅在2D和3D培養(yǎng)模型中對(duì)人結(jié)腸癌上皮(Caco-2)細(xì)胞的毒性作用,首先通過(guò)透射電鏡和納米粒度儀對(duì)納米氧化鋅粒子的形狀、粒徑大小和分布進(jìn)行表征。在2D和3D培養(yǎng)條件下,利用倒置顯微鏡觀察納米氧化鋅染毒Caco-2細(xì)胞對(duì)其形態(tài)的影響,采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性,對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平,炎癥因子白細(xì)胞介素-8(IL-8)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)熒光顯微鏡觀察AO/EB雙染后的2D細(xì)胞死亡形態(tài),同時(shí)借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同的細(xì)胞死亡方式。試驗(yàn)結(jié)果如下:(1)三種納米氧化鋅樣品的平均粒徑為24.53±8.54 nm,56.18±9.56 nm,87.26±13.47 nm。(2)納米氧化鋅引起2D細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,而沒(méi)有引起3D細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。24 nm納米氧化鋅對(duì)2D細(xì)胞的毒性最大,56 nm納米氧化鋅略低,87 nm納米氧化鋅則最小。三種納米氧化鋅的3D細(xì)胞活力差異沒(méi)有顯著性,表明納米氧化鋅的粒徑大小對(duì)3D細(xì)胞的毒性影響沒(méi)有明顯差異。3D細(xì)胞活性明顯高于2D細(xì)胞,表明納米氧化鋅對(duì)2D細(xì)胞毒性明顯高于3D細(xì)胞。(3)3D細(xì)胞相比2D細(xì)胞具有更高的基礎(chǔ)ROS水平。2D細(xì)胞的ROS水平呈依賴劑量的方式增加,而3D細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著增加。24 nm納米氧化鋅誘導(dǎo)2D細(xì)胞氧化應(yīng)激程度最高,56 nm納米氧化鋅略低,87 nm納米氧化鋅則最低,而粒徑大小對(duì)3D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激程度的影響沒(méi)有明顯差異。高濃度納米氧化鋅(≥75μg/mL)染毒12 h后誘導(dǎo)2D細(xì)胞氧化應(yīng)激程度高于3D細(xì)胞。相比2D細(xì)胞,納米氧化鋅誘導(dǎo)了3D細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。3D細(xì)胞的炎癥因子表達(dá)量呈劑量依賴方式增加,24 nm納米氧化鋅誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)最強(qiáng)烈。24 nm和56 nm納米氧化鋅誘導(dǎo)2D細(xì)胞炎癥反應(yīng)的結(jié)果相似,而87 nm納米氧化鋅相對(duì)較低。在3D培養(yǎng)條件下,納米氧化鋅誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與ROS水平無(wú)關(guān)。(4)在2D培養(yǎng)條件下濃度為75μg/mL的24 nm納米氧化鋅引起的晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞數(shù)量最多。在兩種細(xì)胞培養(yǎng)條件下24 nm納米氧化鋅引起Caco-2細(xì)胞死亡數(shù)量都以劑量依賴方式增加。3D細(xì)胞相比2D細(xì)胞對(duì)24 nm納米氧化鋅的毒性響應(yīng)明顯較低。2D培養(yǎng)條件下壞死成為細(xì)胞死亡的主要方式,而3D培養(yǎng)條件下細(xì)胞凋亡成為主要死亡方式。
【關(guān)鍵詞】：納米氧化鋅 Caco-2細(xì)胞 三維 細(xì)胞毒性 炎癥反應(yīng) 細(xì)胞死亡
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114;TB383.1
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 緒論15-26
• 1.1 引言15
• 1.2 納米材料的應(yīng)用15-17
• 1.2.1 納米技術(shù)15-16
• 1.2.2 納米材料產(chǎn)品16
• 1.2.3 納米氧化鋅的應(yīng)用16-17
• 1.3 納米氧化鋅的毒理學(xué)研究進(jìn)展17-20
• 1.3.1 納米氧化鋅對(duì)細(xì)胞的影響17-19
• 1.3.2 納米氧化鋅對(duì)動(dòng)物的作用19
• 1.3.3 納米材料在體內(nèi)和體外細(xì)胞模型中的毒性作用比較19-20
• 1.4 納米氧化鋅的毒性作用機(jī)制20-22
• 1.4.1 活性氧自由基的產(chǎn)生20-21
• 1.4.2 鋅離子的釋放21-22
• 1.5 三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)的研究背景和進(jìn)展22-25
• 1.5.1 3D細(xì)胞培養(yǎng)的研究背景22
• 1.5.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)22-23
• 1.5.3 3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立23-24
• 1.5.4 Caco-23D細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立24-25
• 1.6 本課題的研究?jī)?nèi)容及意義25-26
• 2 納米氧化鋅的表征26-31
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-27
• 2.3 方法27
• 2.4 結(jié)果27-29
• 2.4.1 納米氧化鋅樣品的粒徑形態(tài)27
• 2.4.2 納米氧化鋅樣品的粒徑分布27-28
• 2.4.3 納米氧化鋅樣品的平均粒徑28-29
• 2.5 討論29-31
• 3 納米氧化鋅對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性作用31-39
• 3.1 前言31
• 3.2 材料31-32
• 3.2.1 細(xì)胞株31
• 3.2.2 主要試劑31-32
• 3.2.3 主要儀器32
• 3.3 方法32-34
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)32-33
• 3.3.2 細(xì)胞染毒處理33
• 3.3.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察33
• 3.3.4 細(xì)胞活性檢測(cè)33-34
• 3.3.5 數(shù)據(jù)處理34
• 3.4 結(jié)果34-37
• 3.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察34-35
• 3.4.2 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果35-37
• 3.5 討論37-39
• 4 納米氧化鋅引起Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的研究39-50
• 4.1 前言39
• 4.2 材料39-40
• 4.2.1 細(xì)胞株39-40
• 4.2.2 主要試劑40
• 4.2.3 主要儀器40
• 4.3 方法40-41
• 4.3.1 細(xì)胞染毒處理40
• 4.3.2 Caco-2 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的測(cè)定40
• 4.3.3 炎癥因子表達(dá)的測(cè)定40-41
• 4.3.4 數(shù)據(jù)處理41
• 4.4 結(jié)果41-48
• 4.4.1 ROS水平檢測(cè)結(jié)果41-43
• 4.4.2 炎癥因子IL-8的表達(dá)43-45
• 4.4.3 炎癥因子IL-1β的表達(dá)45-48
• 4.5 討論48-50
• 5 納米氧化鋅引起Caco-2 細(xì)胞死亡的研究50-57
• 5.1 前言50-51
• 5.2 材料51
• 5.2.1 細(xì)胞株51
• 5.2.2 主要試劑51
• 5.2.3 主要儀器51
• 5.3 方法51-52
• 5.3.1 細(xì)胞染毒處理51
• 5.3.2 AO/EB雙染51
• 5.3.3 細(xì)胞死亡方式的測(cè)定51-52
• 5.3.4 數(shù)據(jù)處理52
• 5.4 結(jié)果52-55
• 5.4.1 AO/EB雙染結(jié)果52-53
• 5.4.2 細(xì)胞死亡方式的測(cè)定結(jié)果53-55
• 5.5 討論55-57
• 6 結(jié)論57-60
• 6.1 研究總結(jié)57-59
• 6.2 課題展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-67
• 作者簡(jiǎn)歷67

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本文編號(hào)：901816