本文關(guān)鍵詞：酪胺酶聯(lián)免疫檢測方法的研究

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【摘要】：酪胺是生物胺的一種,通過微生物對食品中游離酪氨酸的脫羧基作用形成。由于其含量變化可以客觀地反映肉類腐敗變質(zhì)進(jìn)程,因此它可以作為評價肉類新鮮度及腐敗品質(zhì)變化的重要指標(biāo)。本文建立了一種具有高特異性的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)來檢測食品中的酪胺。 采用甲醛法和戊二醛法,將酪胺分別與牛血清白蛋白、卵清蛋白偶聯(lián),成功制備了酪胺的免疫原與包被原。通過免疫新西蘭大耳白兔得到高效價的特異性抗血清,使用Protein A Sepharose-4B親和層析法純化抗血清得到酪胺多克隆抗體。本研究建立了間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法,對影響實驗的各因素(包被原包被量,抗體稀釋度,羊抗兔HRP標(biāo)記二抗稀釋度,封閉液等)進(jìn)行了優(yōu)化與篩選,最終確定包被原包被量為0.1μg/孔,抗體稀釋度為1：500,羊抗兔HRP標(biāo)記二抗的稀釋度為1：15000,封閉液為0.5%乳粉/PBS溶液,抗體與標(biāo)準(zhǔn)品的孵育溫度為25℃,在此工作條件下所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度最高,穩(wěn)定性最好。本研究所建立方法的靈敏度(IC50)為0.20±0.015mg/L,檢測限(IC15)為0.02±0.004mg/L。所制備的抗體具有良好的特異性,與酪氨酸、苯乙胺、組胺、色胺均無交叉反應(yīng)。 本研究通過對樣品前處理條件的優(yōu)化,消除了樣品基質(zhì)影響,得到一種簡單可行的樣品處理方法,并將建立的方法應(yīng)用于豬肉、牛肉、魷魚、鱈魚中酪胺的檢測,樣品檢出限是1.20mg/kg。當(dāng)酪胺標(biāo)準(zhǔn)品的添加濃度為12,24,60mg/kg時,所有樣品的回收率在80.71-101.12%之間,且變異系數(shù)(n=3)均小于10%。所得結(jié)果與高效液相色譜法(HPLC)的檢測值具有很好的一致性(R2=0.9893),這表明所建立的方法具有很好的準(zhǔn)確性,本研究建立的酶聯(lián)免疫方法成本低廉,操作簡便,適合于食品中酪胺的快速檢測。
【關(guān)鍵詞】：酪胺 抗體 酶聯(lián)免疫 檢測 食品
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R155.5
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-6
• 目錄6-8
• 1 前言8-24
• 1.1 食品安全現(xiàn)狀8-9
• 1.2 生物胺簡介9-15
• 1.2.1 生物胺的理化性質(zhì)及毒性9-11
• 1.2.2 食品中生物胺的含量11-14
• 1.2.3 生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)14-15
• 1.3 酪胺簡介15-20
• 1.3.1 酪胺的形成途徑15
• 1.3.2 酪胺的藥理學(xué)作用及危害15-16
• 1.3.3 酪胺的檢測方法16-19
• 1.3.4 肉制品中酪胺的控制手段19-20
• 1.4 酶聯(lián)免疫檢測方法概述20-22
• 1.4.1 酶聯(lián)免疫檢測方法的原理20
• 1.4.2 酶聯(lián)免疫檢測方法的主要類型20-21
• 1.4.3 酶聯(lián)免疫檢測方法的應(yīng)用21-22
• 1.5 論文研究的目的及意義22-23
• 1.6 論文的研究內(nèi)容23-24
• 2 材料與方法24-39
• 2.1 實驗材料24-28
• 2.1.1 實驗藥品及試劑24-25
• 2.1.2 實驗儀器及材料25-26
• 2.1.3 基質(zhì)樣品26
• 2.1.4 常用溶液的配制26-28
• 2.2 實驗方法28-39
• 2.2.1 酪胺免疫原的制備28-31
• 2.2.2 酪胺包被原的制備31
• 2.2.3 酪胺多克隆抗體的制備31-34
• 2.2.4 酪胺間接競爭ELISA方法的建立34-35
• 2.2.5 酪胺抗體特異性的測定35
• 2.2.6 樣品基質(zhì)的消除35-36
• 2.2.7 酪胺間接競爭ELISA性能指標(biāo)的評價36-37
• 2.2.8 高效液相色潛法(HPLC)驗證37-39
• 3 結(jié)果與討論39-59
• 3.1 酪胺人工抗原的制備39
• 3.2 酪胺多克隆抗體的制備39-43
• 3.2.1 抗血清效價及特異性測定39-42
• 3.2.2 抗體的純化42-43
• 3.3 酪胺間接競爭ELISA方法的建立43-49
• 3.3.1 包被原的包被量及抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化43-44
• 3.3.2 羊抗兔HRP標(biāo)記二抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化44-45
• 3.3.3 封閉液的確定45-46
• 3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液pH的確定46-47
• 3.3.5 抗體與標(biāo)準(zhǔn)品孵育溫度的確定47
• 3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中甲醇含量對間接競爭ELISA的影響47-48
• 3.3.7 酪胺間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制48-49
• 3.4 酪胺抗體特異性的測定49-50
• 3.5 基質(zhì)影響的消除50-53
• 3.5.1 提取溶劑的選擇50-51
• 3.5.2 樣品提取液稀釋倍數(shù)的優(yōu)化51
• 3.5.3 提取溶劑濃度的優(yōu)化51-52
• 3.5.4 樣品提取液掩蔽劑的優(yōu)化52
• 3.5.5 樣品提取液除脂次數(shù)的優(yōu)化52-53
• 3.5.6 樣品提取時間的優(yōu)化53
• 3.5.7 酪胺間接競爭ELISA法的樣品檢測限53
• 3.6 間接競爭ELISA的性能指標(biāo)評價53-56
• 3.6.1 檢測限與靈敏度53-54
• 3.6.2 精密度54-55
• 3.6.3 穩(wěn)定性55-56
• 3.7 高效液相色譜法對間接競爭ELISA方法有效性的驗證56-59
• 3.7.1 酪胺高效液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制56-57
• 3.7.2 高效液相色譜法對酪胺間接競爭ELISA的驗證57-59
• 4 結(jié)論59-60
• 5 展望60-61
• 6 參考文獻(xiàn)61-68
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況68-69
• 8 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：896154