本文關(guān)鍵詞：大氣顆粒物對血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及其相關(guān)機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 大氣顆粒物 PM_(2.5) 毒性機(jī)制 CRISPR-Cas9

【摘要】：近年來,北京空氣污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重,霧霾天氣引發(fā)了社會各界的廣泛關(guān)注。大氣顆粒物作為主要的環(huán)境污染物已經(jīng)嚴(yán)重影響了人們的日常生活和身體健康。作為大氣顆粒物的重要組成部分,PM_(2.5)已經(jīng)成為影響人體健康的重要威脅。目前,已經(jīng)有大量的流行病學(xué)研究表明,PM_(2.5)通過呼吸道進(jìn)入人體,能夠引發(fā)人體的呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病,同時已有研究表明,PM_(2.5)的濃度與癌癥的發(fā)生率也有密切聯(lián)系。在PM_(2.5)引發(fā)人體心血管疾病的研究中,流行病學(xué)研究已經(jīng)指出,高血壓、動脈粥樣硬化等疾病與PM_(2.5)的吸入濃度息息相關(guān),也有毒理學(xué)研究表明,這些疾病的發(fā)生與PM_(2.5)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān),但PM_(2.5)導(dǎo)致動脈粥樣硬化等心血管疾病的具體毒性作用機(jī)制還并未明確指出。為了進(jìn)一步研究PM_(2.5)的毒性機(jī)制,本課題采用血管內(nèi)皮細(xì)胞作為細(xì)胞模型,采集北京地區(qū)2014年1月的PM_(2.5),研究PM_(2.5)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及相關(guān)機(jī)制。同時,有研究提出,AhR是環(huán)境污染物誘導(dǎo)動脈硬化發(fā)生的可能機(jī)制之一,結(jié)合本課題的研究結(jié)果,為了進(jìn)一步對其機(jī)制進(jìn)行研究,本課題還利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了敲除人AhR基因的慢病毒質(zhì)粒。本課題的研究結(jié)果表明,PM_(2.5)對細(xì)胞毒性明顯,并且PM_(2.5)濃度與毒性存在劑量效應(yīng)關(guān)系。PM_(2.5)可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)微核產(chǎn)生率增加,進(jìn)一步推測PM_(2.5)可能誘發(fā)細(xì)胞染色體損傷。利用透射電子顯微鏡觀察PM_(2.5)在細(xì)胞中的作用位置和暴露于PM_(2.5)后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)PM_(2.5)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有存在且產(chǎn)生影響,尤其導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的改變。同時發(fā)現(xiàn),PM_(2.5)會誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生,自噬參與到了PM_(2.5)對細(xì)胞的毒性作用過程中并起到保護(hù)細(xì)胞的作用。在基因表達(dá)譜的檢測中發(fā)現(xiàn),PM_(2.5)誘發(fā)細(xì)胞中很多與炎癥、氧化應(yīng)激和血管功能障礙相關(guān)的基因的表達(dá)變化,其中,AhR及其靶基因CYP1B1的表達(dá)上調(diào),HMOX1作為一種氧化應(yīng)激的關(guān)鍵基因,它的表達(dá)上調(diào)表明HMOX1在細(xì)胞抗PM_(2.5)的損傷過程中可能起到了關(guān)鍵作用,凝血因子F3的表達(dá)上調(diào)可能是PM_(2.5)引發(fā)動脈硬化等心血管疾病的機(jī)制之一,其可能作為PM_(2.5)對人體心血管損傷的一種標(biāo)志物。同時,PM_(2.5)還影響細(xì)胞p53信號通路、NF-kB信號通路等信號通路。同時,本課題利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了用于敲除人AhR基因的慢病毒質(zhì)粒,為后續(xù)慢病毒的包裝及人AhR基因的在PM_(2.5)引發(fā)心血管疾病尤其是動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制與功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：大氣顆粒物 PM_(2.5) 毒性機(jī)制 CRISPR-Cas9
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R122
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 主要英文縮寫詞7-12
• 第1章 緒論12-22
• 1.1 PM_(2.5) 簡介12-14
• 1.1.1 PM_(2.5) 的定義及其來源12
• 1.1.2 PM_(2.5) 與人體健康效應(yīng)12-13
• 1.1.3 PM_(2.5) 環(huán)境質(zhì)量相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展13-14
• 1.2 PM_(2.5) 的毒理學(xué)研究14-16
• 1.2.1 PM_(2.5) 的毒性作用機(jī)制14
• 1.2.2 PM_(2.5) 的毒性效應(yīng)指標(biāo)14-15
• 1.2.3 PM_(2.5) 的心血管毒性效應(yīng)機(jī)制15-16
• 1.2.4 芳香烴受體及其在環(huán)境污染物對心血管毒性效應(yīng)中的作用研究16
• 1.3 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用16-19
• 1.3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)16-17
• 1.3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制17-18
• 1.3.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯優(yōu)勢18
• 1.3.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因敲除及毒理學(xué)研究中的應(yīng)用18-19
• 1.4 本課題的研究內(nèi)容19-20
• 1.4.1 PM_(2.5) 對人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的毒性及其機(jī)制研究19
• 1.4.2 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的質(zhì)粒構(gòu)建19-20
• 1.5 本課題研究技術(shù)路線20-22
• 1.5.1 PM_(2.5) 對人血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的毒性及其機(jī)制研究20
• 1.5.2 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的質(zhì)粒構(gòu)建20-22
• 第2章 PM_(2.5) 對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用及自噬效應(yīng)研究22-38
• 2.1 引言22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株22
• 2.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 2.3.1 大氣PM_(2.5) 采集24
• 2.3.2 提取PM_(2.5) 顆粒24
• 2.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 2.3.4 細(xì)胞染毒25
• 2.3.5 細(xì)胞存活率檢測25
• 2.3.6 細(xì)胞凋亡檢測25-26
• 2.3.7 細(xì)胞染色體損傷檢測26
• 2.3.8 透射電鏡觀察PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響26
• 2.3.9 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)26-28
• 2.3.10 自噬效應(yīng)研究28-29
• 2.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析29-35
• 2.4.1 PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞存活率的影響29-30
• 2.4.2 PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞凋亡的影響30-31
• 2.4.3 PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞染色體損傷的影響31
• 2.4.4 PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響31-34
• 2.4.5 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白表達(dá)34
• 2.4.6 PM_(2.5) 對HUVEC細(xì)胞自噬效應(yīng)研究34-35
• 2.5 討論35-36
• 2.6 本章小結(jié)36-38
• 第3章 PM_(2.5) 對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)譜分析38-56
• 3.1 引言38
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株38
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)動物38
• 3.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑38-39
• 3.2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器39
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法39-44
• 3.3.1 數(shù)字基因表達(dá)譜檢測39
• 3.3.2 實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因表達(dá)39-41
• 3.3.3 Western Bolt驗(yàn)證差異基因的蛋白表達(dá)41-43
• 3.3.4 ELISA檢測小鼠血清中F3的表達(dá)情況43-44
• 3.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法44
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析44-53
• 3.4.1 差異表達(dá)基因分析44-47
• 3.4.2 Gene Ontology (GO)功能顯著性分析47-48
• 3.4.3 KEGG pathway顯著性富集分析48-50
• 3.4.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因差異表達(dá)50-51
• 3.4.5 Western Blot檢測差異基因蛋白水平表達(dá)51-53
• 3.4.6 小鼠血清中F3的表達(dá)53
• 3.5 討論53-54
• 3.6 本章小結(jié)54-56
• 第4章 CRISPR-Cas9敲除人AhR基因的質(zhì)粒構(gòu)建56-64
• 4.1 引言56
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料56-57
• 4.2.1 菌株和質(zhì)粒56
• 4.2.2 工具和內(nèi)切酶56
• 4.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器56-57
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法57-59
• 4.3.1 gRNA序列的設(shè)計與合成57
• 4.3.2 寡核苷酸退火連接57
• 4.3.3 載體質(zhì)粒lentiCRISPR-V2酶切及膠回收57-58
• 4.3.4 載體與目的片段的連接反應(yīng)58
• 4.3.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化58-59
• 4.3.6 小提并鑒定連接產(chǎn)物59
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-61
• 4.4.1 慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPR-V2酶切結(jié)果59-60
• 4.4.2 慢病毒質(zhì)粒lentiCRISPR-V2膠回收結(jié)果60
• 4.4.3 重組質(zhì)粒測序鑒定結(jié)果60-61
• 4.5 討論61-63
• 4.6 本章小結(jié)63-64
• 結(jié)論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 攻讀碩士期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文72-74
• 致謝74

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本文編號：875426