發(fā)布時(shí)間：2017-09-15 19:43

  本文關(guān)鍵詞：納米銀誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及其毒性機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 納米銀 銀離子 A549細(xì)胞 HepG2細(xì)胞 細(xì)胞毒性 氧化應(yīng)激

【摘要】：納米科技快速發(fā)展,納米材料相關(guān)產(chǎn)品不斷開發(fā)和廣泛應(yīng)用。由于納米銀具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性,因此被廣泛應(yīng)用于光學(xué)、衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域,是目前商品化程度最高的納米材料之一。納米銀產(chǎn)品的不斷開發(fā)和應(yīng)用,人體可能直接接觸納米銀相關(guān)產(chǎn)品或者暴露于含納米銀的環(huán)境中,這可能對(duì)人體構(gòu)成潛在威脅。體內(nèi)研究顯示納米銀可以通過(guò)不同的途徑進(jìn)入生物體,繼而跨越生物屏障分布到不同的組織器官,對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒作用。體內(nèi)研究提示肝臟和肺臟可能是納米銀的蓄積和作用靶器官。體外細(xì)胞研究表明,納米銀可以引起多種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。目前,關(guān)于納米銀引起細(xì)胞毒性的作用機(jī)制還不是十分清楚,還有許多問題亟待解決。比如納米銀引起細(xì)胞毒作用與氧化應(yīng)激關(guān)系,納米銀的毒作用是由納米銀粒子還是其釋放的銀離子引起。因此本研究選擇靶器官肺臟、肝臟來(lái)源的兩種細(xì)胞株作為研究對(duì)象,人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞(HepG2)。通過(guò)一系列研究比較納米銀對(duì)兩株細(xì)胞的毒效應(yīng),并探討氧化應(yīng)激與細(xì)胞毒作用關(guān)系,考察納米銀釋放的銀離子在細(xì)胞毒性中的作用,進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。1、納米銀表征與體外穩(wěn)定性研究：PVP包被納米銀經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)觀察,納米銀顆粒為球形,分散均勻,無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象,平均粒徑為23.44+4.92 nm。馬爾文粒度分析儀測(cè)得使用不含血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為61.89 nm,而使用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為51.58nm,表明納米銀顆粒在培養(yǎng)液中有團(tuán)聚現(xiàn)象,血清有助于其分散。使用超純水、PBS和生理鹽水分散的納米銀在4℃、25℃和37℃孵育48 h內(nèi)最大紫外吸收峰和水合粒徑都沒有改變,而使用DMEM培養(yǎng)液稀釋的納米銀溶液在4℃條件下分散穩(wěn)定,在25℃和37℃時(shí)出現(xiàn)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象,表明不同分散液、時(shí)間和溫度對(duì)納米銀體外分散都有影響。2、納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞毒性研究：20～640ng/mL納米銀染毒A549和HepG2細(xì)胞24、48 h后,兩株細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性下降；在相同染毒條件下,A549細(xì)胞存活率下降更加明顯。20～160μg/mL納米銀染毒兩株細(xì)胞24、48 h后可以引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,具體表現(xiàn)為：20、40 μg/mL劑量下細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化；80、160μg/mL劑量下細(xì)胞間距增加、細(xì)胞皺縮變圓、漂浮細(xì)胞增加、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較,染毒24 h后各劑量組A549細(xì)胞凋亡率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而各劑量組HepG2田胞凋亡率均增加；染毒48 h后,40-160μg/mL劑量組A549細(xì)胞和160 μg/mL劑量組HepG2細(xì)胞凋亡率均增加。使用5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞2 h后,與相應(yīng)染毒時(shí)間的160μg/mL劑量組比較,兩株細(xì)胞凋亡率均顯著下降。以上研究表明納米銀可以引起兩株細(xì)胞增殖抑制、形態(tài)學(xué)改變和凋亡率增加,這可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧增加相關(guān)。3、納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用研究：脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)80、160μg/mL劑量組A549細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量顯著增加；而各劑量組HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量都沒有顯著增加。超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),納米銀染毒A549細(xì)胞24 h后,SOD活力沒有明顯改變,GSH含量上升；染毒48 h后,SOD活力和GSH含量在40～160 μg/mL劑量組下降。納米銀染毒HepG2細(xì)胞24、48h后,SOD活力和GSH含量都表現(xiàn)為上升。此外,納米銀染毒兩株細(xì)胞48 h后,細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激蛋白Hsp70和HO-1表達(dá)都增加。以上研究表明納米銀可以引起A549細(xì)胞發(fā)生更明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化,這可能與兩株細(xì)胞內(nèi)不同的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。4、細(xì)胞攝取納米銀定量及其分布研究：通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)胞攝取的銀含量,結(jié)果顯示納米銀染毒兩株細(xì)胞24、48 h后,細(xì)胞攝取銀含量都呈現(xiàn)劑量依賴性增加,但沒有時(shí)間依賴性。表現(xiàn)為低劑量時(shí)(20μg/mL) 24 h細(xì)胞攝取的銀含量小于48 h；高劑量時(shí)(80、160Hg/mL) 24h細(xì)胞攝取的銀含量大于48 h。通過(guò)超速離心加超濾法分離染毒液銀離子和細(xì)胞內(nèi)銀離子發(fā)現(xiàn),使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀溶液在0h時(shí),銀離子含量呈劑量依賴性增加,其中160μg/mL染毒液銀離子釋放最多,約為37ng/mL;于37℃孵育24、48 h后,只有在160μg/mL染毒液能檢測(cè)到微量銀離子。細(xì)胞內(nèi)銀離子含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞內(nèi)銀離子含量呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性增加,而HepG2細(xì)胞只呈現(xiàn)劑量依賴性增加。硝酸銀染毒兩株細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)相同銀含量的硝酸銀對(duì)兩株細(xì)胞活力影響大于納米銀。經(jīng)TEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn),納米銀顆�？梢酝ㄟ^(guò)胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞,主要分布在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和溶酶體中；在HepG2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和溶酶體中。研究表明兩株細(xì)胞可以通過(guò)胞吞途徑攝取銀顆粒,并在細(xì)胞內(nèi)釋放銀離子,進(jìn)而引起細(xì)胞毒性。5、納米銀誘導(dǎo)A549口HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制研究：納米銀染毒A549和HepG2細(xì)胞48 h后,Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549和HepG2細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C、AIF、Caspase3、 Caspase8 和 Caspase9蛋白表達(dá)水平均顯著升高,Bcl-2/Bax的比值顯著降低。結(jié)果表明納米銀誘導(dǎo)兩株細(xì)胞凋亡涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。綜上所述,納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。兩株細(xì)胞在40～160μg/mL濃度下48 h,A549細(xì)胞比HepG2細(xì)胞顯示更明顯的增殖抑制和凋亡。納米銀可以通過(guò)胞吞途徑被細(xì)胞攝取,并在細(xì)胞內(nèi)釋放銀離子,進(jìn)而引起細(xì)胞毒作用。納米銀誘導(dǎo)兩株細(xì)胞凋亡涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。造成兩株細(xì)胞毒性差異的原因可能是A549細(xì)胞攝取銀顆粒在體內(nèi)釋放的銀離子高于Hep G2細(xì)胞；納米銀引起A549細(xì)胞發(fā)生更強(qiáng)的氧化應(yīng)激作用。本研究在細(xì)胞和分子水平初步探究了納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞毒作用機(jī)制及其差異原因,為納米銀的安全性評(píng)價(jià)以及應(yīng)用提供毒理學(xué)資料。
【關(guān)鍵詞】：納米銀 銀離子 A549細(xì)胞 HepG2細(xì)胞 細(xì)胞毒性 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114;TB383.1
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 主要縮略詞12-14
• 前言14-18
• 第一章 納米銀表征與體外穩(wěn)定性研究18-24
• 1 材料與方法18-19
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-22
• 3 討論22-23
• 本章小結(jié)23-24
• 第二章 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞毒性研究24-41
• 第一節(jié) 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞活力影響24-29
• 第二節(jié) 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞形態(tài)影響29-34
• 第三節(jié) 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞凋亡率影響的研究34-40
• 本章小結(jié)40-41
• 第三章 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用研究41-55
• 第一節(jié) 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用研究41-48
• 第二節(jié) 納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響48-54
• 本章小結(jié)54-55
• 第四章 細(xì)胞攝取納米銀定量及其分布研究55-70
• 第一節(jié) A549和HepG2細(xì)胞攝取納米銀定量分析55-64
• 第二節(jié) A549和HepG2細(xì)胞攝取納米銀及其分布研究64-69
• 本章小結(jié)69-70
• 第五章 納米銀誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究70-77
• 1 材料與方法70-71
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果71-74
• 3 討論74-76
• 本章小結(jié)76-77
• 總結(jié)與展望77-79
• 參考文獻(xiàn)79-85
• 綜述85-92
• 參考文獻(xiàn)90-92
• 作者簡(jiǎn)介92-93
• 在研期間發(fā)表論文93-94
• 致謝94

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