本文關(guān)鍵詞：低劑量亞砷酸鈉致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Involucrin表達(dá)變化及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 亞砷酸鈉 Involucrin JNK c-Jun 人角質(zhì)形成細(xì)胞

【摘要】：目的Involucrin是交聯(lián)包膜的蛋白前體,其不僅作為表皮角質(zhì)細(xì)胞早期分化的標(biāo)記,同時(shí)也是鱗狀上皮細(xì)胞終末分化的標(biāo)記。研究表明,Involucrin在多種腫瘤呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),在腫瘤的診斷中發(fā)揮重要作用。然而其在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的不同階段的表達(dá)變化及相應(yīng)的變化機(jī)制目前尚不清楚。本研究以低劑量亞砷酸鈉長(zhǎng)期染毒致永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞(Human Keratinocytes,Ha Ca T)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型為研究載體,檢測(cè)此過(guò)程中Involucrin表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,并以JNK/c-Jun信號(hào)通路為切入點(diǎn)探討引起Involucrin表達(dá)變化的分子機(jī)制。方法1.建立低劑量亞砷酸鈉致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型:以Ha Ca T細(xì)胞為研究對(duì)象,常規(guī)培養(yǎng)24h后,再分別加入含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)直至35代(約18周)后,觀察檢測(cè)細(xì)胞惡性程度。2.細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)x實(shí)驗(yàn):分別收集傳代對(duì)照和1.0μmol/L Na As O2染毒14、21、28和35代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,接種相同數(shù)量細(xì)胞于二十四孔板中,每天計(jì)數(shù),連續(xù)六天,最后計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn):將21、28、35代染毒組和傳代對(duì)照組的Ha Ca T細(xì)胞分別與0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖培養(yǎng)基等體積混合后,鋪于含有0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖的下層培養(yǎng)基上,凝固后,表面加入適量的DMEM完全培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng),每3d換一次液,培養(yǎng)過(guò)程中動(dòng)態(tài)觀察,3周后終止培養(yǎng)并停止計(jì)數(shù)。4.氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè):收集染毒組處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同代數(shù)Ha Ca T細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。5.Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá):收集染毒組和對(duì)照組處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)定其濃度,然后用SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,用特異性一抗孵育4℃過(guò)夜,結(jié)合二抗后,用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)相關(guān)蛋白磷酸化水平及其表達(dá)情況。6.SP600125抑制JNK的表達(dá):選取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的第35代Ha Ca T細(xì)胞,加入SP600125(JNK的特異性抑制劑)分別作用兩天、五天后,檢測(cè)相關(guān)蛋白磷酸化水平及表達(dá)改變情況及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化程度。結(jié)果1.低劑量Na As O2連續(xù)慢性處理致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化:分別用含0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)Ha Ca T細(xì)胞18周,從28代開(kāi)始MMP-9表達(dá)明顯升高,細(xì)胞的遷徙、轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng);且35代細(xì)胞形態(tài)明顯改變,細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快,倍增時(shí)間顯著縮短;與此同時(shí),1.0μmol/L Na As O2染毒的Ha Ca T細(xì)胞能在軟瓊脂培養(yǎng)基上形成更多、更大的細(xì)胞集落,說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞具有惡性表型。2.低劑量Na As O2連續(xù)慢性處理致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Involucrin及JNK/c-Jun通路變化情況:Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn),在染毒中后期(14代~35代)隨著染毒細(xì)胞代數(shù)的增加,Involucrin的表達(dá)逐漸增加;ROS活性則在染毒初期(1代)明顯升高,在隨后的暴露過(guò)程中ROS水平呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),14代達(dá)最高點(diǎn)之后ROS活性逐漸降低,在35代時(shí)活性明顯低于對(duì)照細(xì)胞。在染毒中后期,p-JNK、c-Jun的表達(dá)水平逐漸升高,而Jun B、Jun D、JNK蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化。結(jié)果提示Na As O2誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS激活JNK/c-Jun的表達(dá)可能參與到Involucrin的表達(dá)升高中。3.JNK/c-Jun信號(hào)通路對(duì)低劑量Na As O2染毒致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后Involucrin表達(dá)的作用:選取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的第35代Ha Ca T細(xì)胞,分別加入SP600125(JNK的特異性的抑制劑)兩天、五天后,JNK、p-JNK表達(dá)水平降低,成功的阻滯了JNK通路,而c-Jun表達(dá)水平也隨之降低,同時(shí)Involucrin的表達(dá)水平明顯降低,更重要的是我們的軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)胞集落的數(shù)量減少且體積變小,提示細(xì)胞惡性程度也降低。結(jié)果提示JNK/c-Jun信號(hào)通路參與調(diào)控Na As O2致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Involucrin的表達(dá),同時(shí)也與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的進(jìn)展有關(guān)。結(jié)論低劑量Na As O2連續(xù)慢性染毒致Ha Ca T細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,Involucrin蛋白的表達(dá)逐漸增加,JNK/c-Jun信號(hào)通路參與調(diào)控Involucrin蛋白的表達(dá),抑制JNK活性能夠減少惡性轉(zhuǎn)化Ha Ca T細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá),進(jìn)而降低其惡性程度。
【關(guān)鍵詞】：亞砷酸鈉 Involucrin JNK c-Jun 人角質(zhì)形成細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 亞砷酸鈉致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立15-24
• 1 材料與方法15-20
• 1.1 材料15-16
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 2 結(jié)果20-22
• 2.1 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性染毒致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形態(tài)學(xué)改變20-21
• 2.2 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性染毒致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化MMP-9 表達(dá)改變21
• 2.3 惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)改變21-22
• 2.4 惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞軟瓊脂集落形成22
• 3 討論22-24
• 第二部分 低劑量NaAsO_2致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Involucrin及JNK/c-Jun通路變化情況24-31
• 1 材料與方法24-26
• 1.1 材料24-25
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法25-26
• 2 結(jié)果26-29
• 2.1 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中Involucrin的表達(dá)水平26
• 2.2 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中ROS水平的影響26-27
• 2.3 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中JNK/c-Jun通路蛋白的表達(dá)水平27-29
• 3 討論29-31
• 第三部分JNK/c-Jun信號(hào)通路對(duì)低劑量NaAsO_2染毒致HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化后Involucrin表達(dá)的作用31-37
• 1 材料與方法31-32
• 1.1 材料31
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法31-32
• 2 結(jié)果32-35
• 2.1 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞后JNK表達(dá)水平的改變32-33
• 2.2 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞后c-Jun及Involucrin表達(dá)水平的改變33-34
• 2.3 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細(xì)胞后細(xì)胞惡性程度的改變34-35
• 3 討論35-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-45
• 綜述：砷化物致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化生物標(biāo)志物的研究45-56
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間科研成果56-58
• 中英文縮略語(yǔ)對(duì)照表58-59
• 致謝59-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 王惠惠;徐苑苑;鄭怡;張強(qiáng);孫貴范;;活性氧在亞砷酸鈉誘導(dǎo)Chang肝細(xì)胞凋亡中的作用[J];中國(guó)地方病防治雜志;2009年05期

2 胡宇,金喜梅,王國(guó)荃,Snow ET;砷誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型的建立[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2004年01期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 郝明明;Cyclin D1、CDK4、P16及Rb基因在砷誘發(fā)HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中的表達(dá)及意義[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：660860