本文關(guān)鍵詞：低劑量亞砷酸鈉致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Involucrin表達變化及其機制研究

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【摘要】：目的Involucrin是交聯(lián)包膜的蛋白前體,其不僅作為表皮角質(zhì)細胞早期分化的標記,同時也是鱗狀上皮細胞終末分化的標記。研究表明,Involucrin在多種腫瘤呈現(xiàn)高表達狀態(tài),在腫瘤的診斷中發(fā)揮重要作用。然而其在腫瘤發(fā)生過程中的不同階段的表達變化及相應的變化機制目前尚不清楚。本研究以低劑量亞砷酸鈉長期染毒致永生化人角質(zhì)形成細胞(Human Keratinocytes,Ha Ca T)惡性轉(zhuǎn)化細胞模型為研究載體,檢測此過程中Involucrin表達的動態(tài)變化,并以JNK/c-Jun信號通路為切入點探討引起Involucrin表達變化的分子機制。方法1.建立低劑量亞砷酸鈉致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化模型:以Ha Ca T細胞為研究對象,常規(guī)培養(yǎng)24h后,再分別加入含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)直至35代(約18周)后,觀察檢測細胞惡性程度。2.細胞生長動力學x實驗:分別收集傳代對照和1.0μmol/L Na As O2染毒14、21、28和35代處于對數(shù)生長期細胞,接種相同數(shù)量細胞于二十四孔板中,每天計數(shù),連續(xù)六天,最后計算細胞倍增時間。3.軟瓊脂克隆形成實驗:將21、28、35代染毒組和傳代對照組的Ha Ca T細胞分別與0.7%低熔點瓊脂糖培養(yǎng)基等體積混合后,鋪于含有0.7%低熔點瓊脂糖的下層培養(yǎng)基上,凝固后,表面加入適量的DMEM完全培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng),每3d換一次液,培養(yǎng)過程中動態(tài)觀察,3周后終止培養(yǎng)并停止計數(shù)。4.氧化應激指標的檢測:收集染毒組處于生長對數(shù)期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T細胞,采用流式細胞儀檢測不同代數(shù)Ha Ca T細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。5.Western blot檢測蛋白的表達:收集染毒組和對照組處于生長對數(shù)期的0、1、7、14、21、28和35代Ha Ca T細胞,提取細胞總蛋白并測定其濃度,然后用SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,用特異性一抗孵育4℃過夜,結(jié)合二抗后,用化學發(fā)光法檢測相關(guān)蛋白磷酸化水平及其表達情況。6.SP600125抑制JNK的表達:選取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的第35代Ha Ca T細胞,加入SP600125(JNK的特異性抑制劑)分別作用兩天、五天后,檢測相關(guān)蛋白磷酸化水平及表達改變情況及細胞惡性轉(zhuǎn)化程度。結(jié)果1.低劑量Na As O2連續(xù)慢性處理致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化:分別用含0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)Ha Ca T細胞18周,從28代開始MMP-9表達明顯升高,細胞的遷徙、轉(zhuǎn)移能力逐漸增強;且35代細胞形態(tài)明顯改變,細胞生長速度加快,倍增時間顯著縮短;與此同時,1.0μmol/L Na As O2染毒的Ha Ca T細胞能在軟瓊脂培養(yǎng)基上形成更多、更大的細胞集落,說明此時細胞具有惡性表型。2.低劑量Na As O2連續(xù)慢性處理致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Involucrin及JNK/c-Jun通路變化情況:Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn),在染毒中后期(14代~35代)隨著染毒細胞代數(shù)的增加,Involucrin的表達逐漸增加;ROS活性則在染毒初期(1代)明顯升高,在隨后的暴露過程中ROS水平呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,14代達最高點之后ROS活性逐漸降低,在35代時活性明顯低于對照細胞。在染毒中后期,p-JNK、c-Jun的表達水平逐漸升高,而Jun B、Jun D、JNK蛋白的表達沒有明顯的變化。結(jié)果提示Na As O2誘導產(chǎn)生ROS激活JNK/c-Jun的表達可能參與到Involucrin的表達升高中。3.JNK/c-Jun信號通路對低劑量Na As O2染毒致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化后Involucrin表達的作用:選取含有0.0、1.0μmol/L Na As O2的DMEM完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)的第35代Ha Ca T細胞,分別加入SP600125(JNK的特異性的抑制劑)兩天、五天后,JNK、p-JNK表達水平降低,成功的阻滯了JNK通路,而c-Jun表達水平也隨之降低,同時Involucrin的表達水平明顯降低,更重要的是我們的軟瓊脂克隆實驗結(jié)果顯示,細胞集落的數(shù)量減少且體積變小,提示細胞惡性程度也降低。結(jié)果提示JNK/c-Jun信號通路參與調(diào)控Na As O2致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Involucrin的表達,同時也與細胞惡性轉(zhuǎn)化的進展有關(guān)。結(jié)論低劑量Na As O2連續(xù)慢性染毒致Ha Ca T細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中,Involucrin蛋白的表達逐漸增加,JNK/c-Jun信號通路參與調(diào)控Involucrin蛋白的表達,抑制JNK活性能夠減少惡性轉(zhuǎn)化Ha Ca T細胞Involucrin蛋白的表達,進而降低其惡性程度。
【關(guān)鍵詞】：亞砷酸鈉 Involucrin JNK c-Jun 人角質(zhì)形成細胞
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 亞砷酸鈉致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化模型的建立15-24
• 1 材料與方法15-20
• 1.1 材料15-16
• 1.2 實驗方法16-20
• 2 結(jié)果20-22
• 2.1 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性染毒致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化形態(tài)學改變20-21
• 2.2 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性染毒致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化MMP-9 表達改變21
• 2.3 惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細胞生長動力學改變21-22
• 2.4 惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細胞軟瓊脂集落形成22
• 3 討論22-24
• 第二部分 低劑量NaAsO_2致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Involucrin及JNK/c-Jun通路變化情況24-31
• 1 材料與方法24-26
• 1.1 材料24-25
• 1.2 實驗方法25-26
• 2 結(jié)果26-29
• 2.1 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中Involucrin的表達水平26
• 2.2 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中ROS水平的影響26-27
• 2.3 低劑量NaAsO_2連續(xù)慢性處理致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中JNK/c-Jun通路蛋白的表達水平27-29
• 3 討論29-31
• 第三部分JNK/c-Jun信號通路對低劑量NaAsO_2染毒致HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)化后Involucrin表達的作用31-37
• 1 材料與方法31-32
• 1.1 材料31
• 1.2 實驗方法31-32
• 2 結(jié)果32-35
• 2.1 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細胞后JNK表達水平的改變32-33
• 2.2 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細胞后c-Jun及Involucrin表達水平的改變33-34
• 2.3 SP600125處理惡性轉(zhuǎn)化HaCaT細胞后細胞惡性程度的改變34-35
• 3 討論35-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-45
• 綜述：砷化物致細胞惡性轉(zhuǎn)化生物標志物的研究45-56
• 參考文獻49-56
• 攻讀碩士學位期間科研成果56-58
• 中英文縮略語對照表58-59
• 致謝59-61

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王惠惠;徐苑苑;鄭怡;張強;孫貴范;;活性氧在亞砷酸鈉誘導Chang肝細胞凋亡中的作用[J];中國地方病防治雜志;2009年05期

2 胡宇,金喜梅,王國荃,Snow ET;砷誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)化模型的建立[J];新疆醫(yī)科大學學報;2004年01期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 郝明明;Cyclin D1、CDK4、P16及Rb基因在砷誘發(fā)HaCaT細胞惡性轉(zhuǎn)變過程中的表達及意義[D];大連醫(yī)科大學;2011年

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本文編號：660860