本文關(guān)鍵詞：三氯乙烯對人正常肝細胞亞細胞蛋白質(zhì)組影響的研究

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【摘要】：目的: 觀察三氯乙烯(trichloroethylene,TCE)對人正常肝細胞(L-02細胞)亞細胞蛋白質(zhì)組的影響,探討其潛在肝毒性作用機制。方法： (1)細胞增殖水平的測定及膜蛋白富集的驗證。采用CCK-8的方法建立TCE致L-02肝細胞劑量-反應(yīng)關(guān)系,通過SPSS軟件計算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。在IC50確定的基礎(chǔ)上,以IC50值倍減的濃度梯度進行TCE染毒,進行細胞增殖實驗,以測定細胞的增殖活性。利用Proteo ExtractTM subcellular proteome extraction kit試劑盒提取膜蛋白組分、核蛋白組分和胞漿蛋白組分。以Na+/K+-ATPase作為膜蛋白的標志物,通過Western Blot分析膜蛋白組分和胞漿蛋白組分中Na+/K+-ATPase的表達水平,總蛋白組分作為對照組進行膜蛋白富集的驗證。以Lamin B1作為核蛋白的標志物,同樣通過Western Blot分析其表達水平,總蛋白做對照。(2)2D-DIGE(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis)結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)技術(shù)分析篩選并鑒定差異表達亞細胞蛋白。具體方法是2.0 mmol/L和8.0 mmol/L TCE處理L-02細胞后提取膜蛋白組分和核蛋白組分,未經(jīng)TCE處理的L-02細胞所提取的膜蛋白組分作為對照組,共分成4批細胞提取。提取的膜蛋白組分經(jīng)過準確定量后,進行熒光標記和雙向電泳。獲得的圖像經(jīng)過掃描后使用De Cyder software package進行分析,尋找到差異表達的蛋白點后進行普通雙向考染,接著對考染的膠進行挖膠酶解,最后獲得的樣品進行MALDI-TOF/TOF-MS鑒定分析,核蛋白組分也按照上述方法進行處理分析。(3)生物信息學分析。通過在線分析軟件TMpred program對鑒定出來的膜蛋白組成差異蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain)的預(yù)測。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建L-02細胞經(jīng)過TCE處理與未經(jīng)過TCE處理差異表達的膜蛋白及核蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行生物過程富集分析。(4)TCE染毒L-02細胞后差異表達亞細胞蛋白的驗證。分別以0mmol/L、2.0 mmol/L、4.0 mmol/L、8.0 mmol/L劑量的TCE染毒L-02肝細胞,24 h后,用Western Blot去檢測差異表達膜蛋白和核蛋白,驗證前期亞細胞蛋白質(zhì)組學篩選鑒定結(jié)果的可靠性。結(jié)果： (1)TCE染毒L-02細胞24 h后的半數(shù)抑制濃度為16.0 mmol/L。采用1/2的IC50為最大染毒劑量,發(fā)現(xiàn)2.0 mmol/L,4.0 mmol/L,8.0 mmol/L TCE染毒組與對照組(0 mmol/L)相比均具有顯著性差異,TCE對細胞的增殖活性產(chǎn)生影響顯著。Na+/K+-ATPase在膜蛋白組分中的表達水平顯著高于在全蛋白組分和胞漿蛋白組分(全蛋白質(zhì)、胞漿蛋白和膜蛋白質(zhì)的相對濃度分別為1.0±0.10、0.12±0.01和1.5±0.16,P0.01)。Lamin B1在核蛋白組分的表達水平顯著高于全蛋白和胞漿蛋白組分(全蛋白質(zhì)、胞漿蛋白和核蛋白質(zhì)的相對濃度分別為1.0±0.05、0.08±0.01和2.3±0.28,P0.01)。這些結(jié)果表明膜蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)均在各自組分得到良好的富集,可用于后續(xù)分析。(2)利用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS的方法共鑒定出15個差異蛋白。通過TMpred數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)在膜蛋白組分的15個差異蛋白中,有10個具有1個以上的跨膜結(jié)構(gòu)域,說明這10個蛋白為膜蛋白。另外4個蛋白沒有跨膜區(qū),但它們的亞細胞定位與細胞膜相關(guān)。而在核蛋白組分的24個差異蛋白中,有22蛋白的亞細胞定位與細胞核相關(guān)。DAVID富集分析表明差異表達蛋白主要與RNA過程相關(guān),尤其在RNA剪接這一生物學過程出現(xiàn)明顯的聚集。通過STRING分析,膜蛋白功能富集較松散,核蛋白功能富集較緊密。(3)不同濃度TCE處理前后膜蛋白ATP合成酶β亞基(ATP5B)、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(P4HB)、核蛋白核不均一性核糖核蛋白H2(HNRNPH2)和上游識別序列結(jié)合蛋白(FUBP1)的表達水平。所有驗證的蛋白變化趨勢與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致(P0.05或P0.01)。結(jié)論： (1)本研究應(yīng)用一種提取亞細胞器的方法,該方法能有效地富集L-02細胞的膜蛋白和核蛋白組分,2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS技術(shù)可實現(xiàn)差異亞細胞蛋白的鑒定分析,為外源性化合物致細胞的亞細胞蛋白質(zhì)組學研究提供了新思路和新方法。(2)TCE染毒可以引起L-02肝細胞中膜蛋白質(zhì)組表達水平的改變,這些差異蛋白在細胞死亡調(diào)節(jié)、細胞凋亡調(diào)節(jié)及細胞穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)聚集,相互作用分析顯示功能富集比較松散。Western Blot結(jié)果顯示ATP5B和P4HB的變化水平和蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。(3)TCE染毒可以引起L-02細胞核蛋白質(zhì)組表達水平的改變,這些差異蛋白主要在RNA剪切過程中出現(xiàn)聚集,相互作用分析顯示功能富集比較密集。Western Blot結(jié)果顯示HNRNPH2和FUBP1的變化水平和蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。
【關(guān)鍵詞】：三氯乙烯(TCE) 人正常肝細胞(L-02細胞) 亞細胞蛋白質(zhì) 膜蛋白質(zhì) 核蛋白質(zhì)
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 第一章 前言11-23
• 1 三氯乙烯毒理學研究11-13
• 2 亞細胞蛋白質(zhì)組學最新進展13-16
• 3 本課題已有研究基礎(chǔ)16-17
• 4 課題研究目的及實驗方案17-23
• 第二章 細胞增殖的測定及亞細胞蛋白富集的驗證23-36
• 1 引言23
• 2 實驗材料23-28
• 3 實驗方法28-32
• 4 結(jié)果32-35
• 5 討論35
• 6 本章小結(jié)35-36
• 第三章TCE對L-02 細胞膜蛋白質(zhì)組的影響36-56
• 1 引言36
• 2 實驗材料36-37
• 3 實驗方法37-42
• 4 結(jié)果42-54
• 5 討論54-55
• 6 本章小結(jié)55-56
• 第四章TCE對L-02 細胞核蛋白質(zhì)組的影響56-77
• 1 引言56
• 2 實驗材料56-57
• 3 實驗方法57-58
• 4 結(jié)果58-75
• 5 討論75-76
• 6 本章小結(jié)76-77
• 第五章 差異表達蛋白的驗證77-85
• 1 引言77-78
• 2 實驗材料78
• 3 實驗方法78-79
• 4 結(jié)果79-82
• 5 討論82-83
• 6 本章小結(jié)83-85
• 結(jié)論85-87
• 展望87-89
• 參考文獻89-98
• 附錄98-100
• 英文縮略詞表98-99
• 攻碩期間發(fā)表論文99-100
• 致謝100

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：605469