本文關(guān)鍵詞：漢陽PM2.5對人胚胎干細(xì)胞來源的成纖維細(xì)胞的遺傳毒性及DNA損傷的機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大氣顆粒物(particulate mater,PM)日漸成為眾所關(guān)注的環(huán)境問題和社會(huì)問題,因其對人體健康的危害極大而越來越受到世界各國政府和衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的關(guān)注。其中危害尤其嚴(yán)重的為細(xì)顆粒物PM2.5,它能夠引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等一系列引起健康危害的疾病,而且可能引起免疫、生殖和發(fā)育毒性,甚至有致畸、致突變和致癌的危險(xiǎn),因此其不僅嚴(yán)重影響當(dāng)代人的健康,也影響下一代的健康。近年來,PM的毒性研究大多采用A549、Beas-2B等永生化的細(xì)胞系,而常用的遺傳毒性評價(jià)模型一般采用CHL等細(xì)胞系。但是以上細(xì)胞系具有遺傳物質(zhì)改變、種屬差異等缺點(diǎn),因此建立基于人源正常細(xì)胞的毒性評價(jià)體系,是毒理學(xué)評價(jià)研究方法的發(fā)展趨勢。故本研究中采用來源于人胚胎干細(xì)胞系H9的成纖維細(xì)胞EBf-H9(embryo body fibroblasts-H9),EBf-H9的體外培養(yǎng)和分化條件已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化,遺傳特征與體內(nèi)正常成纖維細(xì)胞接近,并且批次間差異小,可傳代次數(shù)多,核型穩(wěn)定,重復(fù)性強(qiáng),較傳統(tǒng)細(xì)胞系能更準(zhǔn)確反映人體細(xì)胞對毒物的真實(shí)反應(yīng)。目的本研究采用EBf-H9細(xì)胞作為毒性評價(jià)模型研究漢陽PM2.5所致的DNA損傷,旨在揭示漢陽PM2.5 DNA損傷的作用模式與可能機(jī)制,為PM2.5的風(fēng)險(xiǎn)評估提供一個(gè)新的可選細(xì)胞模型,并為后續(xù)進(jìn)一步機(jī)制研究提供一定參考。方法采用透射電鏡觀察PM2.5的形態(tài);將漢陽PM2.5配制成濃度為6.25g/ml、12.5 g/ml、25 g/ml、50 g/ml、100 g/ml、200 g/ml、400 g/ml的染毒液,應(yīng)用CCK-8試劑盒及LDH試劑盒檢測漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細(xì)胞的細(xì)胞存活率和LDH漏出率;采用HE染色的方法觀察漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細(xì)胞的形態(tài);采用DCFH-DA探針檢測漢陽PM2.5染毒1h EBf-H9細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)總ROS含量;采用SOD試劑盒、GPx試劑盒、MDA試劑盒檢測漢陽PM2.5染毒6h EBf-H9細(xì)胞內(nèi)總SOD、總GPx、總MDA含量;選取細(xì)胞存活率90%以上相對無毒性劑量,采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)及雙核細(xì)胞微核試驗(yàn)評價(jià)漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細(xì)胞DNA和染色體損傷程度;采用RT-PCR檢測漢陽PM2.5染毒6h DNA損傷相關(guān)基因p53;采用Western blot檢測漢陽PM2.5染毒6h DNA損傷相關(guān)蛋白γH2AX和PARP。結(jié)果與討論由PM2.5的表征可以看出,漢陽PM2.5中有較規(guī)則的圓球形狀的燃煤飛灰,形狀規(guī)則密實(shí)狀的煙塵集合體,以及形狀不規(guī)則的長形、條狀等鹽類礦物。驗(yàn)證了PM2.5有著復(fù)雜的來源及成分。EBf-H9細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著PM2.5劑量的增加,細(xì)胞存活率逐漸降低,存在劑量效應(yīng)關(guān)系,與人肺成纖維細(xì)胞相比較,該細(xì)胞模型相對更加敏感,細(xì)胞毒性作用更加明顯。而LDH漏出率呈先增加后降低的趨勢,存在劑量效應(yīng)關(guān)系,分析高劑量出現(xiàn)LDH漏出率下降的原因可能是細(xì)胞開始大量死亡,導(dǎo)致LDH釋放程度降低。通過染毒后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察,可以看出,隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。低劑量中開始出現(xiàn)細(xì)胞空泡變性,高劑量中出現(xiàn)核碎裂、核固縮的現(xiàn)象�；钚匝鮎OS是生物體一類含氧化合物的總稱,它包括有氧離子、過氧化物和含氧自由基等。ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),和保持機(jī)體平衡起很大作用。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測ROS結(jié)果看出,隨著染毒劑量的增加,染毒短時(shí)間細(xì)胞內(nèi)總ROS呈上升趨勢,存在劑量效應(yīng)關(guān)系。超氧化物化酶(SOD)能清除機(jī)體內(nèi)過多的氧自由基,保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)將機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能。當(dāng)機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基不能完全被清除時(shí),引發(fā)脂質(zhì)過氧化并形成丙二醛(MDA)之類的脂質(zhì)過氧化物。由氧化損傷指標(biāo)結(jié)果可以看出SOD、GPx隨染毒劑量的升高而減少,MDA隨染毒劑量升高而增加,均存在劑量效應(yīng)關(guān)系,表明隨著劑量的增加細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)就產(chǎn)生大量ROS,當(dāng)ROS不能被清除時(shí),EBf-H9細(xì)胞的SOD與GPx開始激活,抵抗細(xì)胞內(nèi)過多的氧自由基,最終形成產(chǎn)物MDA,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其死亡。單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)與雙核細(xì)胞微核試驗(yàn)是在細(xì)胞的DNA和染色體水平上評價(jià)受試物遺傳毒性的常用方法。結(jié)果顯示隨著PM2.5劑量的增加,彗星拖尾率與雙核細(xì)胞微核率逐漸上升,且存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系,提示漢陽PM2.5造成了EBf-H9細(xì)胞DNA和染色體的損傷,表明漢陽PM2.5可引起細(xì)胞DNA完整性、染色體完整性和染色體分離的改變,具有一定的遺傳毒性。由本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),同目前常用的遺傳毒性的評價(jià)模型CHL細(xì)胞系相比較,EBf-H9細(xì)胞更為敏感。RT-PCR和Western blot的實(shí)驗(yàn)方法廣泛用于檢測目的基因和蛋白的含量。本研究中,RT-PCR的方法檢測EBf-H9細(xì)胞DNA損傷關(guān)鍵基因p53,結(jié)果顯示其表達(dá)呈先上升后下降的趨勢;Western blot方法檢測γH2AX蛋白呈先上升后下降的趨勢,PARP蛋白89kd片段呈整體上升的趨勢。說明EBf-H9細(xì)胞DNA損傷可能是通過p53激活γH2AX造成DNA雙鏈斷裂,并啟動(dòng)修復(fù)蛋白PARP,隨劑量增加,細(xì)胞的修復(fù)能力減弱。但是細(xì)胞DNA損傷是一個(gè)復(fù)雜的通路體系,可能經(jīng)過多條通路、多種基因蛋白的共同調(diào)控作用,要完全揭示其作用模式及通路,還需要進(jìn)一步的深入研究。結(jié)論本研究表明EBf-H9可作為PM2.5風(fēng)險(xiǎn)評估新的候選細(xì)胞模型;漢陽PM2.5具有一定的遺傳毒性;初步表明漢陽PM2.5可導(dǎo)致EBf-H9細(xì)胞的DNA損傷和染色體損傷。由結(jié)果揭示PM2.5可能通過誘導(dǎo)EBf-H9細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS,繼而引發(fā)細(xì)胞自身產(chǎn)生一系列氧化損傷作用,最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷和染色體損傷。在此過程中DNA損傷修復(fù)通路可能是通過p53激活γH2AX,并啟動(dòng)修復(fù)蛋白PARP,在ROS所致的氧化損傷過程中或許具有一定的拮抗作用。
【關(guān)鍵詞】：PM2.5 胚胎干細(xì)胞 成纖維細(xì)胞 遺傳毒性 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分：漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究16-31
• 1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 1.1 細(xì)胞系16
• 1.2 主要試劑16
• 1.3 主要耗材16
• 1.4 主要儀器16-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-24
• 2.1 漢陽PM2.5 的采集17
• 2.2 漢陽PM2.5 的提取17
• 2.3 漢陽PM2.5 的配制17-18
• 2.4 透射電鏡（TEM）觀察漢陽PM2.5 形態(tài)18
• 2.5 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)18
• 2.6 染毒液配制與劑量分組18
• 2.7 CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞存活率18-19
• 2.8 LDH試劑盒檢測LDH漏出率19
• 2.9 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)19-20
• 2.11 細(xì)胞內(nèi)總ROS檢測20
• 2.12 細(xì)胞內(nèi)總SOD檢測20-22
• 2.13 細(xì)胞內(nèi)總GPx檢測22-23
• 2.14 細(xì)胞內(nèi)總MDA檢測23-24
• 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-28
• 4.1 漢陽PM2.5 的表征24-25
• 4.2 漢陽PM2.5 的細(xì)胞毒性25-26
• 4.3 EBf-H9 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察26
• 4.4 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞氧化損傷的影響26-28
• 5 討論28-30
• 6 小結(jié)30-31
• 第二部分：漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞的遺傳毒性研究31-38
• 1 實(shí)驗(yàn)材料31
• 1.1 細(xì)胞系31
• 1.2 主要試劑31
• 1.3 主要耗材31
• 1.4 主要儀器31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)31
• 2.2 染毒液的配制與劑量分組31
• 2.3 其他溶液配制31-32
• 2.4 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)32-33
• 2.5 雙核細(xì)胞微核試驗(yàn)33-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-36
• 3.1 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞彗星拖尾率的影響34-35
• 3.2 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞雙核細(xì)胞微核率的影響35-36
• 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36
• 5 討論36-37
• 6 小結(jié)37-38
• 第三部分：漢陽PM2.5 對EBf-H9 細(xì)胞DNA損傷相關(guān)機(jī)制的研究38-47
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 1.1 細(xì)胞系38
• 1.2 主要試劑38
• 1.3 主要耗材38
• 1.4 主要儀器38-39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-44
• 2.1 RT-PCR試驗(yàn)39-40
• 2.2 蛋白提取與定量40
• 2.3 Western Blot試驗(yàn)檢測蛋白表達(dá)40-44
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-45
• 3.1 P53 的基因表達(dá)44
• 3.2 γH2AX和PARP的蛋白表達(dá)44-45
• 4 討論45-47
• 5 小結(jié)47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 文獻(xiàn)綜述53-62
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 個(gè)人簡歷62-63
• 致謝63

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 戰(zhàn)園;王曉穎;李盛林;傅歆;俞光巖;曹彤;劉鶴;;兩種牙科材料對人胚胎干細(xì)胞來源成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性研究[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年01期

2 賈玉巧;趙曉紅;郭新彪;;大氣顆粒物PM10和PM2.5對人肺成纖維細(xì)胞及其炎性因子分泌的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2011年03期

  本文關(guān)鍵詞：漢陽PM2.5對人胚胎干細(xì)胞來源的成纖維細(xì)胞的遺傳毒性及DNA損傷的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：492217