漢陽PM2.5對人胚胎干細胞來源的成纖維細胞的遺傳毒性及DNA損傷的機制研究
發(fā)布時間:2017-06-28 03:03
本文關鍵詞:漢陽PM2.5對人胚胎干細胞來源的成纖維細胞的遺傳毒性及DNA損傷的機制研究,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
【摘要】:大氣顆粒物(particulate mater,PM)日漸成為眾所關注的環(huán)境問題和社會問題,因其對人體健康的危害極大而越來越受到世界各國政府和衛(wèi)生機構的關注。其中危害尤其嚴重的為細顆粒物PM2.5,它能夠引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等一系列引起健康危害的疾病,而且可能引起免疫、生殖和發(fā)育毒性,甚至有致畸、致突變和致癌的危險,因此其不僅嚴重影響當代人的健康,也影響下一代的健康。近年來,PM的毒性研究大多采用A549、Beas-2B等永生化的細胞系,而常用的遺傳毒性評價模型一般采用CHL等細胞系。但是以上細胞系具有遺傳物質改變、種屬差異等缺點,因此建立基于人源正常細胞的毒性評價體系,是毒理學評價研究方法的發(fā)展趨勢。故本研究中采用來源于人胚胎干細胞系H9的成纖維細胞EBf-H9(embryo body fibroblasts-H9),EBf-H9的體外培養(yǎng)和分化條件已經標準化,遺傳特征與體內正常成纖維細胞接近,并且批次間差異小,可傳代次數(shù)多,核型穩(wěn)定,重復性強,較傳統(tǒng)細胞系能更準確反映人體細胞對毒物的真實反應。目的本研究采用EBf-H9細胞作為毒性評價模型研究漢陽PM2.5所致的DNA損傷,旨在揭示漢陽PM2.5 DNA損傷的作用模式與可能機制,為PM2.5的風險評估提供一個新的可選細胞模型,并為后續(xù)進一步機制研究提供一定參考。方法采用透射電鏡觀察PM2.5的形態(tài);將漢陽PM2.5配制成濃度為6.25g/ml、12.5 g/ml、25 g/ml、50 g/ml、100 g/ml、200 g/ml、400 g/ml的染毒液,應用CCK-8試劑盒及LDH試劑盒檢測漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細胞的細胞存活率和LDH漏出率;采用HE染色的方法觀察漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細胞的形態(tài);采用DCFH-DA探針檢測漢陽PM2.5染毒1h EBf-H9細胞的細胞內總ROS含量;采用SOD試劑盒、GPx試劑盒、MDA試劑盒檢測漢陽PM2.5染毒6h EBf-H9細胞內總SOD、總GPx、總MDA含量;選取細胞存活率90%以上相對無毒性劑量,采用單細胞凝膠電泳試驗及雙核細胞微核試驗評價漢陽PM2.5染毒24h EBf-H9細胞DNA和染色體損傷程度;采用RT-PCR檢測漢陽PM2.5染毒6h DNA損傷相關基因p53;采用Western blot檢測漢陽PM2.5染毒6h DNA損傷相關蛋白γH2AX和PARP。結果與討論由PM2.5的表征可以看出,漢陽PM2.5中有較規(guī)則的圓球形狀的燃煤飛灰,形狀規(guī)則密實狀的煙塵集合體,以及形狀不規(guī)則的長形、條狀等鹽類礦物。驗證了PM2.5有著復雜的來源及成分。EBf-H9細胞毒性試驗結果顯示,隨著PM2.5劑量的增加,細胞存活率逐漸降低,存在劑量效應關系,與人肺成纖維細胞相比較,該細胞模型相對更加敏感,細胞毒性作用更加明顯。而LDH漏出率呈先增加后降低的趨勢,存在劑量效應關系,分析高劑量出現(xiàn)LDH漏出率下降的原因可能是細胞開始大量死亡,導致LDH釋放程度降低。通過染毒后細胞形態(tài)學的觀察,可以看出,隨著染毒劑量的增加,細胞數(shù)量逐漸減少。低劑量中開始出現(xiàn)細胞空泡變性,高劑量中出現(xiàn)核碎裂、核固縮的現(xiàn)象;钚匝鮎OS是生物體一類含氧化合物的總稱,它包括有氧離子、過氧化物和含氧自由基等。ROS在細胞信號傳導,和保持機體平衡起很大作用。根據(jù)流式細胞儀檢測ROS結果看出,隨著染毒劑量的增加,染毒短時間細胞內總ROS呈上升趨勢,存在劑量效應關系。超氧化物化酶(SOD)能清除機體內過多的氧自由基,保護細胞免受氧化損傷。谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)將機體內產生的有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,保護細胞膜的結構及功能。當機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產生氧自由基不能完全被清除時,引發(fā)脂質過氧化并形成丙二醛(MDA)之類的脂質過氧化物。由氧化損傷指標結果可以看出SOD、GPx隨染毒劑量的升高而減少,MDA隨染毒劑量升高而增加,均存在劑量效應關系,表明隨著劑量的增加細胞在短時間內就產生大量ROS,當ROS不能被清除時,EBf-H9細胞的SOD與GPx開始激活,抵抗細胞內過多的氧自由基,最終形成產物MDA,從而誘導細胞凋亡甚至導致其死亡。單細胞凝膠電泳試驗與雙核細胞微核試驗是在細胞的DNA和染色體水平上評價受試物遺傳毒性的常用方法。結果顯示隨著PM2.5劑量的增加,彗星拖尾率與雙核細胞微核率逐漸上升,且存在明顯的劑量效應關系,提示漢陽PM2.5造成了EBf-H9細胞DNA和染色體的損傷,表明漢陽PM2.5可引起細胞DNA完整性、染色體完整性和染色體分離的改變,具有一定的遺傳毒性。由本實驗室以往的研究結果比較發(fā)現(xiàn),同目前常用的遺傳毒性的評價模型CHL細胞系相比較,EBf-H9細胞更為敏感。RT-PCR和Western blot的實驗方法廣泛用于檢測目的基因和蛋白的含量。本研究中,RT-PCR的方法檢測EBf-H9細胞DNA損傷關鍵基因p53,結果顯示其表達呈先上升后下降的趨勢;Western blot方法檢測γH2AX蛋白呈先上升后下降的趨勢,PARP蛋白89kd片段呈整體上升的趨勢。說明EBf-H9細胞DNA損傷可能是通過p53激活γH2AX造成DNA雙鏈斷裂,并啟動修復蛋白PARP,隨劑量增加,細胞的修復能力減弱。但是細胞DNA損傷是一個復雜的通路體系,可能經過多條通路、多種基因蛋白的共同調控作用,要完全揭示其作用模式及通路,還需要進一步的深入研究。結論本研究表明EBf-H9可作為PM2.5風險評估新的候選細胞模型;漢陽PM2.5具有一定的遺傳毒性;初步表明漢陽PM2.5可導致EBf-H9細胞的DNA損傷和染色體損傷。由結果揭示PM2.5可能通過誘導EBf-H9細胞產生大量ROS,繼而引發(fā)細胞自身產生一系列氧化損傷作用,最終導致細胞產生DNA損傷和染色體損傷。在此過程中DNA損傷修復通路可能是通過p53激活γH2AX,并啟動修復蛋白PARP,在ROS所致的氧化損傷過程中或許具有一定的拮抗作用。
【關鍵詞】:PM2.5 胚胎干細胞 成纖維細胞 遺傳毒性 DNA損傷
【學位授予單位】:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2015
【分類號】:R114
【目錄】:
- 縮略詞表5-7
- 中文摘要7-10
- 英文摘要10-14
- 前言14-16
- 第一部分:漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞的細胞毒性研究16-31
- 1 實驗材料16-17
- 1.1 細胞系16
- 1.2 主要試劑16
- 1.3 主要耗材16
- 1.4 主要儀器16-17
- 2 實驗方法17-24
- 2.1 漢陽PM2.5 的采集17
- 2.2 漢陽PM2.5 的提取17
- 2.3 漢陽PM2.5 的配制17-18
- 2.4 透射電鏡(TEM)觀察漢陽PM2.5 形態(tài)18
- 2.5 細胞復蘇與培養(yǎng)18
- 2.6 染毒液配制與劑量分組18
- 2.7 CCK-8 試劑盒檢測細胞存活率18-19
- 2.8 LDH試劑盒檢測LDH漏出率19
- 2.9 HE染色觀察細胞形態(tài)19-20
- 2.11 細胞內總ROS檢測20
- 2.12 細胞內總SOD檢測20-22
- 2.13 細胞內總GPx檢測22-23
- 2.14 細胞內總MDA檢測23-24
- 3 統(tǒng)計學分析24
- 4 實驗結果24-28
- 4.1 漢陽PM2.5 的表征24-25
- 4.2 漢陽PM2.5 的細胞毒性25-26
- 4.3 EBf-H9 細胞的形態(tài)學觀察26
- 4.4 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞氧化損傷的影響26-28
- 5 討論28-30
- 6 小結30-31
- 第二部分:漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞的遺傳毒性研究31-38
- 1 實驗材料31
- 1.1 細胞系31
- 1.2 主要試劑31
- 1.3 主要耗材31
- 1.4 主要儀器31
- 2 實驗方法31-34
- 2.1 細胞復蘇與培養(yǎng)31
- 2.2 染毒液的配制與劑量分組31
- 2.3 其他溶液配制31-32
- 2.4 單細胞凝膠電泳試驗32-33
- 2.5 雙核細胞微核試驗33-34
- 3 實驗結果34-36
- 3.1 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞彗星拖尾率的影響34-35
- 3.2 漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞雙核細胞微核率的影響35-36
- 4 統(tǒng)計學分析36
- 5 討論36-37
- 6 小結37-38
- 第三部分:漢陽PM2.5 對EBf-H9 細胞DNA損傷相關機制的研究38-47
- 1 實驗材料38-39
- 1.1 細胞系38
- 1.2 主要試劑38
- 1.3 主要耗材38
- 1.4 主要儀器38-39
- 2 實驗方法39-44
- 2.1 RT-PCR試驗39-40
- 2.2 蛋白提取與定量40
- 2.3 Western Blot試驗檢測蛋白表達40-44
- 3 實驗結果44-45
- 3.1 P53 的基因表達44
- 3.2 γH2AX和PARP的蛋白表達44-45
- 4 討論45-47
- 5 小結47
- 結論47-48
- 參考文獻48-53
- 文獻綜述53-62
- 參考文獻56-62
- 個人簡歷62-63
- 致謝63
【參考文獻】
中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條
1 戰(zhàn)園;王曉穎;李盛林;傅歆;俞光巖;曹彤;劉鶴;;兩種牙科材料對人胚胎干細胞來源成纖維細胞的細胞毒性研究[J];北京大學學報(醫(yī)學版);2012年01期
2 賈玉巧;趙曉紅;郭新彪;;大氣顆粒物PM10和PM2.5對人肺成纖維細胞及其炎性因子分泌的影響[J];環(huán)境與健康雜志;2011年03期
本文關鍵詞:漢陽PM2.5對人胚胎干細胞來源的成纖維細胞的遺傳毒性及DNA損傷的機制研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
本文編號:492217
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