本文關(guān)鍵詞：一氯、二氯聯(lián)苯和1-羥甲基芘的代謝活化與遺傳毒性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一類包括209個化合物的持久性環(huán)境污染物,因其特殊的理化性質(zhì)曾經(jīng)廣泛用于液壓油、潤滑油、絕緣油和傳熱油等產(chǎn)品中。在數(shù)十年的生產(chǎn)和使用過程中因蓄積與遷移作用造成了“全球性環(huán)境污染”。自1929至1970年代后期PCBs的全球累計產(chǎn)量約為100萬噸,其中一半以上已進入垃圾堆放場或被填埋。中國于1965年至1974年生產(chǎn)了約1萬噸PCBs,產(chǎn)品分布遍及全國。這些含PCBs的產(chǎn)品不可避免地污染了人類生存的環(huán)境。盡管各國立法禁止生產(chǎn)和運輸PCBs超過30年,但其化學穩(wěn)定性使其在環(huán)境中難以降解,同時含PCBs的某些廢舊產(chǎn)品的回收和處理可造成PCBs的集中排放,因此至今仍存在一定的環(huán)境與人體負荷。在各國立法禁止PCBs商業(yè)應用之前,PCBs多以含數(shù)十種氯化程度不等的同系物的混合物形式應用及排放入環(huán)境。PCBs的動物致癌性已被證實多年,但其作用機制不清,致突變性的未得到系統(tǒng)研究。最近具有二惡英類似結(jié)構(gòu)的PCBs已被確認為人類致癌物,其作用主要通過激活芳烴受體。低氯化PCBs代謝速率相對較高,且國內(nèi)外環(huán)境的空氣及水體中都發(fā)現(xiàn)多種低氯化PCBs以不同濃度存在,美國環(huán)境科學研究院已根據(jù)現(xiàn)有動物與細胞試驗資料推測一氯和二氯聯(lián)苯可能經(jīng)一定代謝活化具有較強的致突變性,但該假說迄今尚無直接的實驗數(shù)據(jù)支持。 1-羥甲基芘(1-HMP)是羥甲基多環(huán)芳烴衍生而來的一種芳醇,也是肝致癌物1-甲基芘(1-MP)的主要代謝產(chǎn)物。1-HMP在硫酸基轉(zhuǎn)移酶(SULT)的作用下可進一步代謝為具有親電子活性的代謝物,后者已于最近在小鼠體內(nèi)試驗中證實為1-磺基甲基芘(1-SMP)。然而,1-HMP的誘變性迄今未有報道。目的 人類生物轉(zhuǎn)化酶CYP2E1是苯及其羥化產(chǎn)物的活化酶,而多氯聯(lián)苯的化學結(jié)構(gòu)與苯的羥化代謝物有一定相似度。本研究第一部分擬驗證人CYP2E1活化一氯和二氯聯(lián)苯化合物的可能性,以了解其相關(guān)的遺傳毒性；第二部分則探討人SULT1A1代謝活化條件下1-HMP的遺傳毒作用。 方法 1：通過MTT法觀察用一定濃度的受試物PCBs或1-HMP處理12h,并繼續(xù)培養(yǎng)12h后,中國大鼠肺(V79)細胞和重組表達人CYP2E1和人SULT1A1的V79細胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)的生長情況,以反映其代謝相關(guān)的細胞毒性。 2：用體外微核試驗觀察一定濃度的受試物PCBs(包括2-單氯聯(lián)苯、3-單氯聯(lián)苯、4-單氯聯(lián)苯、2,2’-二氯聯(lián)苯、2,3-二氯聯(lián)苯、2,4-二氯聯(lián)苯、2,4’-二氯聯(lián)苯、2,5-二氯聯(lián)苯、2,6-二氯聯(lián)苯、3,3’-二氯聯(lián)苯、3,4-二氯聯(lián)苯、3,5-二氯聯(lián)苯、4,4’-二氯聯(lián)苯)和1-HMP對上述細胞染毒12h、繼續(xù)培養(yǎng)12h后,微核細胞率的變化,以反映受試物經(jīng)代謝活化后誘導真核細胞染色體畸變的作用。 3：用Hprt位點正向突變試驗觀察用各個PCB化合物和1-HMP誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞的基因突變情況(與對V79細胞作用的結(jié)果相比較),以反映各受試物代謝相關(guān)的致突變性。 4：在上述實驗條件下,以1-氨基苯三唑(1-aminobenzotriazole,ABT, CYP2E1抑制劑)和五氯酚(pentachlorophenol,PCP, SULT1A1抑制劑)分別與各受試物聯(lián)合處理受試細胞,以觀察這兩種酶與各受試物作用的關(guān)系。 5：通過比較各PCB化合物的化學結(jié)構(gòu)與其誘發(fā)細胞微核效能的對應關(guān)系,找出決定10個受試二氯聯(lián)苯中高效能化合物的結(jié)構(gòu)特征。 6：統(tǒng)計學分析：對MTT細胞毒性試驗結(jié)果采用方差分析法(n=6),微 核試驗結(jié)果采用卡方檢驗,致突變試驗結(jié)果則采用Fisher確切概率法。結(jié)果 1.受試物代謝依賴性細胞毒作用 1.1一氯、二氯聯(lián)苯對細胞的作用 所有受試PCBs在10—100μM濃度范圍對V79對照細胞均無細胞毒作用。然而PCB4、PCB5、PCB11在最高濃度(1001μM)對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞具有細胞毒作用(細胞數(shù)減少,p0.05)。PCB10單獨對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞沒有毒作用,但在與PCP聯(lián)合暴露時具有一定細胞毒作用。以0.2%(v：v)乙醇預處理該細胞系則對上述PCBs的細胞毒作用具有一定增強效應。 1.21-羥甲基芘對細胞的作用 1-HMP (1—8μM)對V79對照細胞的生長無影響,然而它對V79-hCYP2El-hSULT1A1細胞在最高濃度明顯抑制細胞的生長(p0.05)。與SULT1A1抑制劑PCP的聯(lián)合暴露則導致1-HMP的作用明顯降低。可見人SULT1A1對1-HMP的代謝活化可導致細胞毒作用。 2.受試物誘發(fā)細胞微核的作用及其代謝依賴性 2.1一氯、二氯聯(lián)苯對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞誘發(fā)微核的作用 所有受試PCBs化合物對V79對照細胞均不誘發(fā)微核,然而它們中除PCB1外,均對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞系誘發(fā)的微核(至少一個劑量組p0.05)。其中PCB4, PCB5, PCB7, PCB8, PCB10, PCB11的作用具有濃度依賴性,其余PCBs則作用效能較低。ABT (20μM)可顯著降低各個化合物的作用(p0.05),而PCP僅對PCB8的作用具有影響(增強作用),而對其它化合物的作用無影響。 2.21-羥甲基芘誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞微核的作用 1-HMP對V79對照細胞的微核細胞率無影響(1-8μM),但是對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞明顯誘導微核,且呈濃度依賴性；PCP則幾乎完全抑制了1-羥甲基芘誘導細胞微核的作用。 3.受試物誘發(fā)細胞Hprt位點正向突變的作用 3.1一氯、二氯聯(lián)苯誘發(fā)細胞基因突變的作用 選用PCB5、PCB8、PCB10和PCB11作為代表性二氯聯(lián)苯化合物測試其誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULTlA1細胞基因突變的效應(同時采用PCP抑制SULT1A1活性)。結(jié)果顯示四個受試物均誘發(fā)基因突變,且呈濃度依賴性；其中,PCB5和PCB10的作用的效能明顯高于另兩個化合物。 3.21-羥甲基芘對細胞的基因突變的結(jié)果 1-HMP (0.5—4μM)對V79對照細胞的基因突變率無影響(p0.05)；然而它對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞強烈誘導基因突變,且作用呈濃度依賴性；PCP同時處理則明顯降低其基因突變率。與基因致突變試驗平行的細胞毒性試驗也呈現(xiàn)相似改變：1-HMP對V79對照細胞的生長無影響,而對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞具有明顯細胞毒性,呈濃度依賴性；PCP的同時暴露則完全抑制其細胞毒性。結(jié)果表明1-HMP的致突變作用依賴于人SULT1A1的代謝活化作用。 4.二氯聯(lián)苯誘發(fā)細胞微核的結(jié)構(gòu)活性-分析 10個二氯聯(lián)苯中,PCB4、PCB5、PCB7、PCB8、PCB10、PCB11這6個PCBs誘發(fā)細胞微核作用的效能較高(并存在明顯的濃度-效應關(guān)系),其中多數(shù)(除PCB11外)在苯環(huán)連接鍵的鄰位存在一個或二個氯取代基結(jié)構(gòu)。而在誘發(fā)微核作用效能較弱的4個受試物中,除PCB9外其它三個化合物都不具有鄰位氯取代基,而是在間位或?qū)ξ缓�。這提示鄰位氯取代結(jié)構(gòu)可能與二氯聯(lián)苯經(jīng)CYP2E1活躍的代謝活化作用有關(guān)。 結(jié)論 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)人CYP2E1具有對PCBs進行代謝活化的作用,而人SULT1A1對多數(shù)PCBs的活化代謝物沒有明顯的滅活作用。 2.一氯、二氯聯(lián)苯化合物經(jīng)人CYP2E1代謝活化后可誘發(fā)細胞染色體畸變及基因突變。 3.由人CYP2E1代謝活化受試PCBs所產(chǎn)生的遺傳毒性,總體上強的遺傳毒性代謝物主要由部分二氯聯(lián)苯代謝而來,相反,一氯聯(lián)苯的遺傳毒性相對較弱。 4.苯環(huán)連接鍵的鄰位含一個或二個氯取代基的二氯聯(lián)苯可能具有較強的CYP2E1代謝依賴性遺傳毒作用；而對位或間位含氯者往往與較低的遺傳毒性有關(guān)。 5.人SULT1A1活化1-HMP后可對真核細胞產(chǎn)生較強的細胞毒性和遺傳毒性,后者包括染色體畸變(由微核形成所提示)和基因突變。
【關(guān)鍵詞】：多氯聯(lián)苯 中國地鼠肺成纖維(V79)細胞 V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞 MTT微核 Hprt位點正向突變 1-羥甲基芘
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 緒論16-22
• 1.1 多氯聯(lián)苯研究背景16-19
• 1.1.1 多氯聯(lián)苯的污染狀況16-17
• 1.1.2 多氯聯(lián)苯的結(jié)構(gòu)與生物活性17-18
• 1.1.3 多氯聯(lián)苯的致癌與遺傳毒性18-19
• 1.2 1-HMP的研究背景19-21
• 1.2.1 1-HMP是1-甲基芘的中間代謝物19
• 1.2.2 SULT1A1是進一步活化1-HMP的最強SULTs亞型19-21
• 1.3 研究目的和意義21
• 1.4 研究的創(chuàng)新之處21-22
• 第二章 一氯、二氯聯(lián)苯的代謝活化與遺傳毒性研究22-44
• 2.1 前言22
• 2.2 實驗材料22-26
• 2.2.1 細胞系22
• 2.2.2 主要試劑22-25
• 2.2.3 主要溶液配置25-26
• 2.2.4 主要儀器設(shè)備26
• 2.3 實驗方法26-31
• 2.4 實驗結(jié)果31-41
• 2.4.1 一氯、二氯聯(lián)苯對細胞的細胞毒性作用31-32
• 2.4.2 一氯、二氯聯(lián)苯對V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞誘發(fā)微核的作用及酶激活/抑制的影響32-36
• 2.4.3 二氯聯(lián)苯誘發(fā)細胞微核的結(jié)構(gòu)-活性分析36-39
• 2.4.4 四個代表性二氯聯(lián)苯誘發(fā)細胞基因突變的作用39-41
• 2.5 討論41-44
• 第三章 1-羥甲基芘的代謝活化與遺傳毒性研究44-50
• 3.1 前言44
• 3.2 實驗材料44
• 3.3 實驗方法44-45
• 3.3.1 1-羥甲基芘誘發(fā)細胞毒性作用(MTT法)44-45
• 3.3.2 體外微核實驗45
• 3.4 實驗結(jié)果45-48
• 3.4.1 1-羥甲基芘的代謝酶依賴性細胞毒作用45-46
• 3.4.2 1-羥甲基芘誘發(fā)細胞微核的作用及其代謝酶依賴性46-47
• 3.4.3 1-羥甲基芘誘發(fā)V79-hCYP2E1-hSULT1A1細胞基因突變47-48
• 3.5 討論48-50
• 參考文獻50-55
• 中英文縮略詞對照表55-56
• 碩士期間發(fā)表論文56-57
• 致謝57-58

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：一氯、二氯聯(lián)苯和1-羥甲基芘的代謝活化與遺傳毒性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：490940