本文關(guān)鍵詞：miR-34a沉默逆轉(zhuǎn)靡爛性毒物對角質(zhì)形成細(xì)胞遷移抑制的作用及機制的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的： 微小RNA（miRNA）是機體一類重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，通過與靶mRNA的3’-UTR區(qū)域不完全配對結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，與機體發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化、DNA損傷修復(fù)、凋亡和腫瘤發(fā)生等眾多生物學(xué)事件密切相關(guān)。miR-34a是p53誘導(dǎo)的miRNA，在DNA損傷應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。芥子氣（sulfur mustard，SM）是皮膚損傷劑，引起皮膚炎癥、紅斑、水皰等病理改變，創(chuàng)面愈合緩慢。目前的研究結(jié)果認(rèn)為芥子氣對DNA的損傷作用是其引起病理變化的分子基礎(chǔ)。我們推測，miR-34a的表達(dá)改變可能在SM對皮膚損傷過程中發(fā)揮作用，干預(yù)其表達(dá)可能會對皮膚的損傷及愈合有影響。因此，本研究中我們用miR-34a的抑制物Ago34a抑制角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)水平，觀察芥子氣模擬物CEES（2-chloroethyl ethyl sulfide，２－氯乙基乙硫醚）染毒后，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、遷移、粘附、侵襲等指標(biāo)的改變，以期明確miR-34a在硫芥損傷的保護(hù)作用，并對遷移，粘附，侵襲相關(guān)蛋白以及激動蛋白聚合狀態(tài)（F-actin）等進(jìn)行檢測，以闡明其作用機制。研究結(jié)果可為后續(xù)在體研究，如使用miR-34a沉默藥物治療芥類毒物皮膚難愈損傷，提供實驗資料。 方法： 第一部分CEES染毒HaCaT細(xì)胞miR-34a的變化 1. CEES染毒HaCaT細(xì)胞模型建立及評價：采用不同CEES劑量（0.2,0.5,1.0，2.0mM）進(jìn)行染毒，染毒后6h使用MTS法檢測細(xì)胞活性，確定后續(xù)試驗染毒的最佳劑量（該劑量對細(xì)胞活性有影響，但細(xì)胞可以耐受）。采用該劑量在染毒后24h光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 2.細(xì)胞分化標(biāo)志物檢測：根據(jù)上述的毒性實驗結(jié)果，確定0.5mM CEES為最佳染毒劑量，使用該劑量染毒24h后，采用基底細(xì)胞未分化標(biāo)志物角質(zhì)蛋白5（K5）和分化標(biāo)志物角質(zhì)蛋白10(K10)對染毒后細(xì)胞的分化情況進(jìn)行檢測，以1.2mM Ca2+誘導(dǎo)分化處理作為陽性對照。 3.用stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNA：使用商品化的miRNA檢測用引物，檢測方法與試劑與Q-PCR檢測mRNA類似。在正式的miRNA檢測前，利用溶解曲線評價miRNA檢測引物的質(zhì)量，同時比較U6和5S作為內(nèi)參在本染毒模型上的穩(wěn)定性。 第二部分miR-34a沉默對CEES染毒前/后細(xì)胞遷移，粘附的影響 1.化學(xué)合成miRNA轉(zhuǎn)染實驗：通過轉(zhuǎn)染效率實驗對轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行評價。用cy3熒光標(biāo)記和未標(biāo)記的miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察cy3陽性細(xì)胞率。miR-34a沉默采用的是商品化的miR-34a沉默（Ago34a）。 2. Western blotting：實驗設(shè)計為6組，分組如下， miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組（Ago34a）和對照抑制劑轉(zhuǎn)染（Ago ctr）組，0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組，0.5mM CEES染毒對照抑制劑轉(zhuǎn)染組（Ago34a+0.5），p38抑制劑干預(yù)0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組（Ago34a+0.5+P38inh），ERK1/2抑制劑干預(yù)0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉(zhuǎn)染組（Ago34a+0.5+ERK1/2inh）,染毒后24h檢測EGFR，ERK1/2總蛋白，以及p38和ERK1/2磷酸化水平。 3.細(xì)胞劃痕實驗：實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞運動遷移的能力。 4.細(xì)胞粘附實驗：實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞粘附底物的能力。 5.細(xì)胞侵襲實驗：實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細(xì)胞穿透基質(zhì)膠（Matrixgel）的能力。 6.免疫熒光染色F-actin：實驗分組同上。F-actin反映actin的聚合程度，與細(xì)胞骨架重塑、遷移、粘附等有關(guān)。本實驗用于觀察各種處理因素下細(xì)胞內(nèi)F-actin的分布和熒光強弱。 7.流式細(xì)胞術(shù)分析F-actin：實驗分組同上。用于準(zhǔn)確反映各種處理因素下細(xì)胞F-actin的平均熒光強度。 8. Western Blotting：實驗分組同上。主要檢測各種處理因素下與遷移相關(guān)的蛋白（miR-34a的靶蛋白或非靶蛋白）的改變。 9.生物信息學(xué)分析：與遷移相關(guān)的蛋白HDAC6，在miR-34a沉默后增加。使用TargetScan預(yù)測和Vector NTI手工比對，預(yù)測HDAC63’-UTR的可能miR-34a結(jié)合位點。 第三部分miR-34a沉默促CEES染毒細(xì)胞遷移的其它因素 1.流式細(xì)胞術(shù)檢測胞膜蛋白Integrin β1：實驗分組同前。檢測了和細(xì)胞粘附，遷移相關(guān)Integrin β1可能和細(xì)胞黏附，遷移相關(guān)。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量：實驗分組同前。檢測了和Integrin β1改變相關(guān)的Ca2+含量。 3. HPLC能量代謝檢測：實驗分組同上。檢測了可能和細(xì)胞遷移相關(guān)的能量代謝的變化。 4. Western Blotting檢測COX-10：實驗分組同上。結(jié)果反映能量代謝中氧化磷酸化功能酶的含量變化。 結(jié)果: 1.在本實驗室建立了CEES體外染毒模型，發(fā)現(xiàn)0.5mM CEES是最佳染毒劑量。該劑量下染毒HaCaT可以觀察到細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力均降低。部分功能和結(jié)構(gòu)蛋白如K5、iNOS、MMP-1、Fra-1降低顯著，Integrin β1略有增加。 2.0.5mM CEES染毒可以顯著降低HaCaT細(xì)胞K5（基底細(xì)胞marker）。但形態(tài)學(xué)和K10的WB結(jié)果表明，并未有明顯的細(xì)胞分化跡象。 3.建立了穩(wěn)定的stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNANA，比較了U6和5S兩個內(nèi)參的穩(wěn)定性（后者更佳），以此法檢測了miR-34a在CEES染毒HaCaT細(xì)胞內(nèi)隨時間后劑量變化后的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-34a在0.2,0.5mM CEES染毒后12h-24h表達(dá)增加，至24h增加3倍左右，，該調(diào)控是通過該細(xì)胞的突變p53來實現(xiàn)的。 4.建立了高轉(zhuǎn)染效率的miRNA轉(zhuǎn)染方法。miR-34a沉默可以增加細(xì)胞遷移和粘附能力。同樣，miR-34a沉默使0.5mM CEES染毒細(xì)胞遷移增加，該遷移能力的變化可以被p38和ERK1/2信號通路抑制劑所降低。miR-34a沉默并未使0.5mM CEES染毒細(xì)胞粘附增加。 5. miR-34a沉默引起0.5mM CEES染毒后一些遷移相關(guān)靶蛋白及信號通路激酶磷酸化增加，如c-myc、c-Met、ARHGAP1、HDAC6，以及p38和ERK1/2的磷酸化。遷移相關(guān)的信號蛋白iNOS增加依賴于ERK1/2通路激活。Fra-1作為已報道的miR-34a靶蛋白未見增加。 6. miR-34a沉默并未顯著改變0.5mM CEES染毒細(xì)胞MMP-1, Integrin β1，Ca2+含量和能量代謝水平。 7. miR-34a沉默顯著增加染毒前/后遷miR-34a沉默引起0.5mM CEES染毒細(xì)胞的ERK1/2信號通路激活，經(jīng)過ERK1/2抑制劑處理后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的分化狀態(tài)。伴隨著胞內(nèi)Ca2+濃度和Integrin β1的明顯增加。 結(jié)論及展望： miR-34a沉默可以顯著增加遷移，并可以部分逆轉(zhuǎn)CEES染毒引起的細(xì)胞遷移降低。miR-34a沉默后引起染毒細(xì)胞遷移增強的作用機制可能是：⑴p-p38和p-ERK1/2信號通路的激活；⑵c-Met蛋白表達(dá)增強，促使該通路的激活；⑶miR-34a靶蛋白ARHGAP1增加，可能引起下游遷移相關(guān)蛋白Rho GTPase增加；⑷HDAC6蛋白增加可能使骨架蛋白和組蛋白去乙�；� 本課題還有其它方面有待深入：⑴未在動物上開展在體驗證實驗；⑵使用的是p53突變型細(xì)胞株HaCaT，在研究毒性和DNA修復(fù)機制方面可能不夠全面；⑶miR-34a靶蛋白改變后的功能沒有進(jìn)行干預(yù)研究，其作用是根據(jù)已有文獻(xiàn)推測的。
【關(guān)鍵詞】：半硫芥 角質(zhì)形成細(xì)胞 miR-34a 遷移 粘附 侵襲 ARHGAP1 肝細(xì)胞因子受體 去乙�；�6 EGFR p38 ERK1/2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-9
• 摘要9-13
• 第一章 前言13-18
• 第二章 CEES 染毒 HaCaT 細(xì)胞 miR-34a 的變化18-27
• 2.1 CEES 染毒模型建立及評價18-20
• 2.2 stem-loop 法 Q-PCR 檢測 miR34-a 表達(dá)20-24
• 2.3 p53 信號通路對 miR-34a 變化的影響24-25
• 討論25-26
• 小結(jié)26-27
• 第三章 miR-34a 沉默對 CEES 染毒前/后細(xì)胞遷移，粘附的影響27-43
• 3.1 p38 和 ERK1/2 信號通路的變化27-29
• 3.2 miR-34a 沉默對 CEES 染毒 HaCaT 遷移，粘附的影響29-36
• 3.3 miR-34a 沉默后遷移相關(guān)蛋白的改變36-40
• 討論40-42
• 小結(jié)42-43
• 第四章 miR-34a 沉默促 CEES 染毒細(xì)胞遷移的其它因素43-49
• 4.1 miR-34a 沉默對 CEES 染毒前/后細(xì)胞 Integrin β1 的影響43-45
• 4.2 miR-34a 沉默對 CEES 染毒細(xì)胞能量代謝的影響45-47
• 討論47-48
• 小結(jié)48-49
• 全文總結(jié)49-50
• 文獻(xiàn)綜述50-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文59-60
• 致謝60

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本文編號：479140