本文關(guān)鍵詞：食品中苯巴比妥快速檢測方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：苯巴比妥是一類精神藥品,常用于鎮(zhèn)靜和催眠。由于利益驅(qū)使,一些不法分子將其非法添加在助眠類保健食品中,長期食用后,苯巴比妥會在體內(nèi)蓄積,對人體健康造成威脅。因此,亟需開發(fā)簡便、快速、高靈敏度的苯巴比妥檢測方法。本論文在此領(lǐng)域開展了以下研究:人工合成苯巴比妥完全抗原并進行鑒定。對苯巴比妥結(jié)構(gòu)進行修飾,合成含有氨基和羧基的苯巴比妥半抗原,經(jīng)重氮法和碳二亞胺法與BSA和OVA制備苯巴比妥人工抗原。通過TLC、質(zhì)譜、核磁對苯巴比妥半抗原進行鑒定,并采用紫外掃描對人工抗原進行結(jié)構(gòu)鑒定,通過動物免疫對人工抗原進行生物學(xué)鑒定,使用ELISA對得到的抗血清進行鑒定分析。結(jié)果表明:苯巴比妥半抗原已成功合成,苯巴比妥與BSA、OVA偶聯(lián)成功,PAPB-BSA偶聯(lián)比為23.20:1,PCPB-BSA偶聯(lián)比為15.44:1,PAPB-OVA偶聯(lián)比為10.91:1。動物免疫表明,免疫的10只小鼠的效價均在103以上,且5號小鼠的抗血清抗苯巴比妥IC50為95.49 ng/mL。本實驗成功合成了苯巴比妥人工抗原,為進一步制備苯巴比妥的特異性抗體與建立苯巴比妥免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。用合成的兩種人工抗原免疫BALB/C小鼠用以制備抗苯巴比妥單克隆抗體,三免后小鼠血清效價可達104,用PEG進行細胞融合,共獲得4株可穩(wěn)定分泌抗苯巴比妥單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水,并用BCA試劑盒測定其蛋白濃度。獲得的抗體進行免疫特性分析,抗體親和常數(shù)為4.13×108 L/mol,IC50為10.76 ng/mL,抗體效價達到了105以上。該抗體除與苯巴比妥鈉交叉反應(yīng)率為87.84%外,與其他苯巴比妥結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)。膠體金免疫層析技術(shù)因為具有簡便快捷、準確直觀等優(yōu)點而成為目前現(xiàn)場實時應(yīng)用最廣泛的一種診斷方法,與單克隆抗體技術(shù)的結(jié)合又使其具有良好的特異性和敏感性。本實驗利用膠體金標(biāo)記的抗苯巴比妥單克隆抗體為探針制備了檢測苯巴比妥的膠體金免疫層析試紙條。利用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑約為33 nm的膠體金。在標(biāo)記苯巴比妥單克隆抗體時,最佳pH值在7左右,最適標(biāo)記抗體濃度為18μg/mL。經(jīng)試驗確定了NC膜抗原最佳包被濃度為1.5 mg/mL,驢抗鼠二抗最佳包被濃度為0.75 mg/mL,同時兩者按照0.75μL/cm噴膜。用組裝好的試紙條檢測苯巴比妥標(biāo)準溶液,檢測限30 ng/mL。檢測添加苯巴比妥的保健食品原料水提取樣本時,檢測限為30 ng/mL。交叉反應(yīng)實驗說明所制備的試紙條與巴比妥、戊巴比妥、異戊巴比妥無交叉反應(yīng)。在室溫干燥條件下試紙條可以保存3個月以上,在不同批次和同一批次內(nèi)有良好的重復(fù)性。本實驗制備的試紙條方便、快捷,在15 min內(nèi)就可以直觀的判斷檢測結(jié)果,適用于現(xiàn)場實時檢測。
【關(guān)鍵詞】：苯巴比妥 人工抗原 單克隆抗體 膠體金 免疫層析試紙條
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R155.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略語表7-12
• 第1章 緒論12-24
• 1.1 引言12-13
• 1.2 苯巴比妥13-16
• 1.2.1 理化性質(zhì)13-14
• 1.2.2 臨床應(yīng)用14-15
• 1.2.3 苯巴比妥的代謝15
• 1.2.4 毒性作用15-16
• 1.3 現(xiàn)有的苯巴比妥檢測方法16-18
• 1.3.1 高效液相色譜法（HPLC）16-17
• 1.3.2 反相高效液相色譜法（RP17
• 1.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）17
• 1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）17
• 1.3.5 毛細管電泳法17-18
• 1.3.6 熒光分析法18
• 1.3.7 其它方法18
• 1.4 膠體金免疫層析技術(shù)18-21
• 1.4.1 膠體金18-19
• 1.4.2 免疫膠體金的制備19
• 1.4.3 膠體金免疫層析技術(shù)的原理19-20
• 1.4.4 膠體金免疫分析法的優(yōu)點20-21
• 1.5 膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測中的應(yīng)用21-22
• 1.5.1 在食品藥物殘留快速檢測中的應(yīng)用21
• 1.5.2 在致病微生物檢測中的應(yīng)用21
• 1.5.3 在真菌毒素檢測中的應(yīng)用21-22
• 1.5.4 在重金屬檢測中的應(yīng)用22
• 1.5.5 在疾病監(jiān)測中的應(yīng)用22
• 1.6 研究目的與意義22-24
• 第2章 苯巴比妥人工抗原合成及鑒定24-40
• 2.1 材料與儀器25-26
• 2.1.1 主要試劑25
• 2.1.2 主要儀器25
• 2.1.3 實驗動物25
• 2.1.4 主要溶液的配制25-26
• 2.2 實驗方法26-29
• 2.2.1 苯巴比妥半抗原的合成26-27
• 2.2.2 苯巴比妥人工抗原合成27
• 2.2.3 人工抗原紫外光譜掃描鑒定27-28
• 2.2.4 動物免疫28
• 2.2.5 間接ELISA分析小鼠抗血清效價28
• 2.2.6 間接競爭ELISA分析小鼠抗血清特異性28-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-38
• 2.3.1 苯巴比妥半抗原TLC監(jiān)測結(jié)果29-31
• 2.3.2 苯巴比妥半抗原質(zhì)譜鑒定結(jié)果分析31-33
• 2.3.3 苯巴比妥半抗原核磁鑒定結(jié)果33-34
• 2.3.4 人工抗原紫外掃描結(jié)果34-36
• 2.3.5 間接ELISA測定小鼠抗血清效價結(jié)果36-37
• 2.3.6 間接競爭ELISA分析小鼠抗血清特異性結(jié)果37-38
• 2.4 討論38-40
• 第3章 苯巴比妥單克隆抗體制備與鑒定40-59
• 3.1 材料與儀器40-42
• 3.1.1 主要試劑40
• 3.1.2 主要儀器40
• 3.1.3 實驗動物和細胞40
• 3.1.4 主要溶液40-42
• 3.2 實驗方法42-50
• 3.2.1 小鼠免疫42-43
• 3.2.2 小鼠效價和抑制水平的測定43
• 3.2.3 雜交瘤細胞株的建立43-47
• 3.2.4 苯巴比妥單克隆抗體的生產(chǎn)47-48
• 3.2.5 苯巴比妥單克隆抗體特性鑒定48-50
• 3.3 結(jié)果與分析50-57
• 3.3.1 免疫小鼠抗血清的篩選和鑒定結(jié)果50-51
• 3.3.2 雜交瘤細胞株的建立51-52
• 3.3.3 苯巴比妥單克隆抗體特性鑒定結(jié)果52-57
• 3.4 討論57-59
• 第4章 苯巴比妥膠體金試紙條的研制59-81
• 4.1 材料與儀器59-60
• 4.1.1 主要試劑59
• 4.1.2 主要儀器59
• 4.1.4 主要溶液59-60
• 4.2 實驗方法60-66
• 4.2.1 膠體金的制備60
• 4.2.2 膠體金的鑒定60-61
• 4.2.3 膠體金標(biāo)記抗體蛋白最佳條件的確定61-62
• 4.2.4 金標(biāo)抗體的制備與純化62-63
• 4.2.5 金標(biāo)抗體活性的鑒定63
• 4.2.6 試紙條制備條件的優(yōu)化63-64
• 4.2.7 試紙條的組裝與測試64-65
• 4.2.8 苯巴比妥膠體金試紙條性能測試65-66
• 4.3 結(jié)果與分析66-79
• 4.3.1 膠體金質(zhì)量鑒定66-68
• 4.3.2 膠體金標(biāo)記抗體蛋白最佳條件優(yōu)化結(jié)果68-71
• 4.3.3 金標(biāo)抗體活性鑒定結(jié)果71-72
• 4.3.4 試紙條制備條件優(yōu)化結(jié)果72-74
• 4.3.5 試紙條測試結(jié)果74-76
• 4.3.6 苯巴比妥膠體金試紙條性能測試結(jié)果76-79
• 4.4 討論79-81
• 第5章 結(jié)論與展望81-83
• 5.1 結(jié)論81-82
• 5.2 展望82
• 5.3 創(chuàng)新點82-83
• 致謝83-84
• 參考文獻84-89
• 附錄1 主要試劑89-91
• 附錄2 主要儀器設(shè)備91-92
• 個人介紹92
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果92

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：食品中苯巴比妥快速檢測方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：433417