目的:探究砷暴露對巨噬細(xì)胞ABCA1啟動子區(qū)DNA甲基化改變和基因表達(dá)的影響,同時明確砷暴露對巨噬細(xì)胞膽固醇流出及細(xì)胞凋亡的作用。方法:分別以0μM、4μM、8μM、12μM次砷酸鈉暴露THP-1巨噬細(xì)胞48 h,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理1 h后與12μM次砷酸鈉共暴露48 h,CCK-8法檢測細(xì)胞活性改變,流式細(xì)胞術(shù)DCFH-DA染色法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激情況,激光共聚焦法檢測細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶胞質(zhì)組分p47phox在細(xì)胞內(nèi)的定位,焦磷酸測序檢測ABCA1基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況,實(shí)時定量PCR檢測ABCA1基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,western檢測ABCA1蛋白在巨噬細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。巨噬細(xì)胞加入50μg/m L ox-LDL誘導(dǎo)48 h以產(chǎn)生泡沫化巨噬細(xì)胞,然后油紅染色法檢測泡沫細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)富集情況,總膽固醇和游離膽固醇檢測試劑盒檢測膽固醇富集和流出情況。最后hoechst染色法、流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測巨噬細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果:THP-1巨噬細(xì)胞生存率與砷暴露濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,12μM次砷酸鈉暴露48 h之后,巨噬細(xì)胞生...

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
英文縮略語表
第一章 引言
第二章 材料和方法
    2.1 主要試劑與儀器
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
    2.2 THP-1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組
    2.3 CCK8法檢測砷暴露半數(shù)抑制濃度
    2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS生成
    2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測p47phox在巨噬細(xì)胞內(nèi)的定位
    2.6 qRT-PCR檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)ABCA1基因的表達(dá)
        2.6.1 引物稀釋
        2.6.2 RNA的抽提
        2.6.3 RNA純度鑒定
        2.6.4 RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
        2.6.5 實(shí)時定量PCR
    2.7 Western-blot法檢測ABCA1蛋白的表達(dá)
        2.7.1 蛋白的樣本制備
        2.7.2 SDS-PAGE電泳
        2.7.3 轉(zhuǎn)膜
        2.7.4 封閉孵育抗體
        2.7.5 化學(xué)發(fā)光,凝膠圖像分析
    2.8 焦磷酸測序檢測ABCA1基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況
    2.9 油紅O染色檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)富集情況
    2.10 Hoechst染色檢測細(xì)胞凋亡
    2.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞凋亡率
    2.12 數(shù)據(jù)處理
第三章 結(jié)果
    3.1 CCK8法檢測砷暴露半數(shù)抑制濃度
    3.2 砷暴露增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞中ROS產(chǎn)生
    3.3 砷暴露增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞中NADPH氧化酶裝配
    3.4 砷暴露促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1基因啟動子區(qū)DNA甲基化
    3.5 砷暴露抑制THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1基因的表達(dá)
    3.6 砷暴露抑制THP-1巨噬細(xì)胞ABCA1蛋白的表達(dá)
    3.7 砷暴露促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)富集抑制膽固醇流出
    3.8 砷暴露促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞凋亡
第四章 討論
第五章 結(jié)論
第六章 綜述
    2.1 砷與活性氧
    2.2 砷與內(nèi)皮功能紊亂
    2.3 砷與NADPH氧化酶(NOX)
    2.4 砷與脂質(zhì)分布及炎癥標(biāo)志物
    2.5 小結(jié)和展望
參考文獻(xiàn)



本文編號：3999949