本文關鍵詞：TaqMan探針熒光PCR法定量檢測水中大腸埃希氏菌方法建立和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1．應用TaqMan探針實時熒光PCR技術(RT-qPCR)，建立大腸埃希氏菌的快速定量檢測方法。 2．優(yōu)化水中細菌富集和DNA提取方法，以便應用RT-qPCR方法的進行水中大腸埃希氏菌的檢測。 3．采用RT-qPCR和多管發(fā)酵法同時檢測實際水樣，驗證RT-qPCR方法的準確性。 方法： 1．根據(jù)大腸埃希氏菌的ydiJ基因，設計引物和探針，并分析其特異性和靈敏性。 2．將分離的目標片斷與T載體連接重組，制備大腸埃希氏菌的質粒DNA標準品。 3．優(yōu)化RT-qPCR反應檢測體系，建立標準曲線，并進行方法學評價。 4．通過比較各種水中細菌富集和DNA提取的方法，確定最佳前處理方法組合。 5．采用RT-qPCR檢測20份水樣，所得結果與多管發(fā)酵法比較，以驗證所建立方法的準確性。 結果： 1．引物ydiJ577的特異性實驗結果表明，，所有的大腸埃希氏菌和志賀氏菌標準菌株均為陽性,9株其它非大腸埃希氏菌標準菌株均為陰性; 2．制備大腸埃希氏菌的質粒DNA經測序比對，結果: Identities=90/91(99%),Gaps=0/91(0%)。，標準品純度：OD260/OD280=0.047/0.026=1.81 3．加標水源水經膜洗脫（L型棒洗脫法），磁珠法提取DNA，所建立的標準曲線線性范圍2.3×100～2.3×106CFU/mL (R2:0.996)、檢測限可達到2.3CFU/mL。 4． RT-qPCR和多管發(fā)酵法檢測實際水樣所得結果具有相關性，r=0.991, P0.01 結論： 1． RT-qPCR方法有很好的特異性，能夠快速、準確地檢測水中大腸埃希氏菌。 2． RT-qPCR方法特別適合在中高程度污染的水樣中定量檢測大腸埃希氏菌。 3． RT-qPCR法可以作為現(xiàn)行標準方法的補充，能夠更加準確、及時地評價水體受糞便污染程度。
【關鍵詞】：水 大腸埃希氏菌 PCR 定量檢測
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R123.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 第一部分 TaqMan探針熒光 PCR 定量檢測大腸埃希氏菌方法的研究11-18
• 1 材料11-12
• 2 方法12-14
• 3 結果14-16
• 4 討論16-18
• 第二部分 飲用水中大腸埃希氏菌富集和 DNA 提取方法優(yōu)化18-23
• 1 材料18
• 2 方法18-20
• 3 結果20-22
• 4 討論22-23
• 第三部分 TaqMan探針熒光 PCR 方法定量檢測水中大腸埃希氏菌及方法比對23-30
• 1 材料23-24
• 2 方法24-25
• 3 結果25-28
• 4 討論28
• 5 結論28-30
• 參考文獻30-33
• 綜述 熒光 PCR 方法定量檢測大腸埃希氏菌的研究進展33-41
• 參考文獻38-41
• 攻讀學位期間本人公開發(fā)表的論文41-42
• 附錄 （部分測序圖及序列對比結果）42-44
• 中英文縮略詞對照表44-45
• 致謝45-46

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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  本文關鍵詞：TaqMan探針熒光PCR法定量檢測水中大腸埃希氏菌方法建立和應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：390942