四氯苯醌(TCBQ)是工業(yè)除草劑五氯酚的代謝產(chǎn)物,其體內(nèi)外模型已顯示出活性氧機(jī)制誘導(dǎo)的肝毒性和遺傳毒性作用。Nrf2/ARE信號(hào)通路在機(jī)體內(nèi)的抗氧化過程中發(fā)揮重要作用,它可以有效誘導(dǎo)Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白的表達(dá)。Keap1和Bach1均是機(jī)體內(nèi)Nrf2/ARE信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子,在Nrf2通路的激活中發(fā)揮重要作用。該研究的目的是為了分析TCBQ能否激活Nrf2/ARE信號(hào)通路,并探討其具體的激活機(jī)制,可以為TCBQ誘導(dǎo)毒性干預(yù)的治療提供依據(jù)。第一部分:Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活需要Nrf2和Keap1的解離,該部分的研究分析了TCBQ能否激活Nrf2信號(hào)通路,并分析了Keap1在Nrf2信號(hào)通路激活中的重要作用。HepG2細(xì)胞在使用TCBQ給藥后,發(fā)現(xiàn)Nrf2及抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表達(dá)上調(diào),并存時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。免疫熒光實(shí)驗(yàn)同樣證明了TC BQ作用后Nrf2表達(dá)的上調(diào)。q RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示了Nrf2而非Keap1基因表達(dá)水平的上調(diào)。Western Blot分別檢測(cè)細(xì)胞核、質(zhì)蛋白內(nèi)Nrf2的變化,清晰證明了Nrf2由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核的過程。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫符號(hào)對(duì)照表
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 四氯苯醌
        1.2.1 四氯苯醌的理化性質(zhì)
        1.2.2 四氯苯醌的用途
    1.3 活性氧的簡(jiǎn)介
    1.4 Nrf2/ARE信號(hào)通路
        1.4.1 Nrf2的結(jié)構(gòu)與功能
        1.4.2 ARE的結(jié)構(gòu)與功能
        1.4.3 Nrf2/ARE通路的作用
    1.5 Keap1依賴的Nrf2調(diào)控
        1.5.1 Keap1的結(jié)構(gòu)與功能
        1.5.2 Keap1對(duì)于Nrf2的調(diào)控機(jī)制
    1.6 Bach1與Nrf2的競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控
    1.7 立體依據(jù)及意義
第二章 TCBQ通過Keap1交聯(lián)二聚體的形成和Ub的轉(zhuǎn)移激活Nrf2通路
    2.1 引言
    2.2 材料與試劑
        2.2.1 儀器設(shè)備
        2.2.2 溶液與試劑
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.3.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.3.3 蛋白質(zhì)的提取
        2.3.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)
        2.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析
        2.3.6 GSH含量測(cè)定
        2.3.7 免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
        2.3.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.3.9 統(tǒng)計(jì)分析
    2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 TCBQ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中Nrf2激活以及HO-1 和NQO1的表達(dá)
        2.4.2 TCBQ增加Nrf2卻減少Keap1的mRNA水平
        2.4.3 TCBQ誘導(dǎo)Nrf2入核并和ARE信號(hào)元件結(jié)合
        2.4.4 TCBQ誘導(dǎo)Keap1交聯(lián)二聚體的形成
        2.4.5 TCBQ不能誘導(dǎo)Keap1和Cul3的解離
        2.4.6 TCBQ降低Nrf2但增加Keap1的泛素化水平
    2.5 討論
第三章 TCBQ通過Bach1快速出核和JNK-P62途徑激活Nrf2通路
    3.1 引言
    3.2 溶液與試劑
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 免疫印跡分析
        3.3.2 免疫熒光分析
        3.3.3 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)
        3.3.4 轉(zhuǎn)染干擾RNA實(shí)驗(yàn)
        3.3.5 熒光定量PCR
        3.3.6 統(tǒng)計(jì)分析
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 TCBQ誘導(dǎo)Bach1的快速出核
        3.4.2 TCBQ誘導(dǎo)Bach1與Crm1交互以及酪氨酸的磷酸化
        3.4.3 TCBQ調(diào)節(jié)Bach1和Nrf2與ARE的結(jié)合
        3.4.4 TCBQ上調(diào)Bach1的泛素化水平
        3.4.5 TCBQ上調(diào)Bach1蛋白和mRN A的表達(dá)水平
        3.4.6 放線菌酮抑制Bach1蛋白的表達(dá)
        3.4.7 P62參與TCBQ誘導(dǎo)的Nrf2激活和抗氧化基因的表達(dá)
        3.4.8 JNK途徑參與TCBQ誘導(dǎo)的P62和HO-1 的表達(dá)
    3.5 總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表科研成果



本文編號(hào)：3861854