適配體是功能性的單鏈非編碼DNA、RNA及其衍生物,可通過(guò)形成包括莖環(huán)、發(fā)夾和G-四鏈體在內(nèi)的多種二級(jí)結(jié)構(gòu),以高親和力和特異性識(shí)別、結(jié)合靶標(biāo),具有穩(wěn)定性好、成本低、保質(zhì)期長(zhǎng)和易于修飾等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本研究擬在國(guó)內(nèi)外有關(guān)寡核苷酸適配體的研究基礎(chǔ)上,以本課題組篩選得到的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌的適配體為原始序列,通過(guò)剪裁、修飾等手段對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化,以期得到親和力、特異性和穩(wěn)定性得到改良的適配體序列。并探討適配體構(gòu)象與其親和力的內(nèi)在關(guān)系,對(duì)其與靶標(biāo)的結(jié)合機(jī)制進(jìn)行深入探究。在此基礎(chǔ)上利用適配體特異性識(shí)別模式,結(jié)合三價(jià)DNA過(guò)氧化物模擬酶(DNAzyme)構(gòu)建一種方便、新穎、靈敏度高的副溶血性弧菌可視化檢測(cè)方法。主要工作內(nèi)容如下:首先,以本課題組篩選得到的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌原始適配體序列為基礎(chǔ),以親和力、特異性和穩(wěn)定性為評(píng)價(jià)指標(biāo),借助剪裁、鎖核酸(LNA)取代和定點(diǎn)突變等優(yōu)化手段,獲得了兩條優(yōu)化后的適配體。其中單增李斯特氏菌優(yōu)化適配體A15-8僅含24個(gè)堿基,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析得出其與單增李斯特氏菌的解離常數(shù)(K_d)值為32.84±1.33nmol...

【文章頁(yè)數(shù)】：67 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略符號(hào)說(shuō)明
1 緒論
    1.1 食源性致病菌及其傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)
        1.1.1 微生物檢測(cè)方法
        1.1.2 分子生物學(xué)方法
        1.1.3 免疫學(xué)方法
    1.2 適配體
        1.2.1 適配體概述
        1.2.2 適配體優(yōu)化方法
            1.2.2.1 截短
            1.2.2.2 化學(xué)修飾
            1.2.2.3 二價(jià)或多價(jià)適配體
            1.2.2.4 隨機(jī)或定點(diǎn)突變
        1.2.3 光學(xué)適配體傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用
            1.2.3.1 化學(xué)發(fā)光法
            1.2.3.2 熒光法
            1.2.3.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜法
            1.2.3.4 表面等離子體共振法
            1.2.3.5 比色法
    1.3 DNA過(guò)氧化物模擬酶
        1.3.1 DNA過(guò)氧化物模擬酶概述
        1.3.2 DNAzyme在致病菌檢測(cè)方面的應(yīng)用和研究進(jìn)展
    1.4 本課題的立題意義與研究?jī)?nèi)容
2 實(shí)驗(yàn)材料和方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 主要儀器
    2.3 適配體序列的表征
        2.3.1 適配體親和力分析
        2.3.2 適配體特異性分析
        2.3.3 適配體穩(wěn)定性分析
    2.4 適配體功能化MNP捕獲效率的考察
        2.4.1 氨基化磁珠的制備與表征
        2.4.2 氨基化磁珠的適配體功能化
        2.4.3 適配體功能化MNP捕獲效率的計(jì)算
        2.4.4 實(shí)際樣品捕獲效率的考察
    2.5 細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)的鑒定
        2.5.1 細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)的初步確定
        2.5.2 利用適配體功能化MNP確定細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)
            2.5.2.1 細(xì)菌破碎液中靶標(biāo)的捕獲
            2.5.2.2 膜蛋白提取液中靶標(biāo)的捕獲
    2.6 副溶血性弧菌可視化檢測(cè)方法的構(gòu)建
        2.6.1 檢測(cè)原理
        2.6.2 適配體傳感器的制備
        2.6.3 副溶血性弧菌的檢測(cè)
        2.6.4 可行性分析
        2.6.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
            2.6.5.1 適配體功能化MNP與 ssDNA連接條件優(yōu)化
            2.6.5.2 適配體傳感器與靶標(biāo)孵育條件優(yōu)化
            2.6.5.3 催化反應(yīng)條件優(yōu)化
        2.6.6 特異性實(shí)驗(yàn)
        2.6.7 副溶血性弧菌的實(shí)際樣品檢測(cè)
3 結(jié)果與討論
    3.1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌適配體的優(yōu)化、機(jī)理研究及簡(jiǎn)單應(yīng)用
        3.1.1 單增李斯特氏菌適配體的優(yōu)化
        3.1.2 單增李斯特氏菌適配體功能化MNP捕獲效率的考察
            3.1.2.1 氨基化磁珠的表征
            3.1.2.2 親和素包被的氨基化磁珠的表征
            3.1.2.3 磁珠與生物素化適配體連接條件的優(yōu)化
            3.1.2.4 適配體功能化MNP與細(xì)菌孵育條件優(yōu)化
            3.1.2.5 適配體功能化MNP富集特異性的考察
            3.1.2.6 適配體功能化MNP的靶標(biāo)捕獲性能
            3.1.2.7 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的實(shí)際樣品富集應(yīng)用
        3.1.3 單增李斯特氏菌適配體細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)的鑒定
    3.2 副溶血性弧菌適配體的優(yōu)化、機(jī)理研究及簡(jiǎn)單應(yīng)用
        3.2.1 副溶血性弧菌適配體的優(yōu)化
        3.2.2 副溶血性弧菌適配體功能化MNP捕獲效率的考察
            3.2.2.1 適配體功能化MNP富集特異性的考察
            3.2.2.2 適配體功能化MNP的靶標(biāo)捕獲性能
            3.2.2.3 副溶血性弧菌的實(shí)際樣品富集應(yīng)用
        3.2.3 副溶血性弧菌表面結(jié)合位點(diǎn)的鑒定
            3.2.3.1 細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)的初步確定
            3.2.3.2 分子下拉確定細(xì)菌表面結(jié)合位點(diǎn)
    3.3 副溶血性弧菌可視化檢測(cè)方法的構(gòu)建
        3.3.1 可行性分析
        3.3.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化
            3.3.2.1 適配體功能化MNP與 ssDNA連接條件優(yōu)化
            3.3.2.2 適配體傳感器與靶標(biāo)孵育條件優(yōu)化
            3.3.2.3 催化反應(yīng)條件優(yōu)化
        3.3.3 適配體傳感器的特異性
        3.3.4 副溶血性弧菌檢測(cè)的線性范圍和檢測(cè)限
        3.3.5 副溶血性弧菌的實(shí)際樣品檢驗(yàn)
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號(hào)：3770238